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软组织肉瘤是一组少见的恶性肿瘤,约占成人恶性肿瘤的1%,儿童恶性肿瘤的10%。软组织肉瘤约有50种不同亚型,它们的临床、病理以及分子学特征均有所不同。目前,软组织肉瘤的治疗仍以手术治疗与化疗为主。但存在术后复发转移、预后差以及化疗效果差等问题。随着分子病理学研究的深入,多个基因被证实与软组织肉瘤的进展相关,但是目前临床上还没有任何一种生物标志物被用于指导预后。加权共表达网络分析（Weighted Gene Co-expression Network Analysis,WGCNA）通过动态剪切树的方法,将表达相似的基因归类于同一个模块,通过临床性状和基因模块间的关联性分析,探究模块与临床性状的相关性,并通过对模块进行网络分析以及功能分析,解释基因模块的功能,筛选出具有生物学意义的核心基因。WGCNA已经在多种实体瘤中用于发现与临床性状或预后相关的基因模块和核心基因,并在实验和临床中得到较好的验证。但是,关于WGCNA在软组织肉瘤中应用的报道较为少见。驱动蛋白家族成员20A（Kinesin Family Member 20A,KIF20A）在细胞有丝分裂、细胞迁移和胞内转运中发挥作用。已有大量研究证明,KIF20A在多种肿瘤中异常高表达,并显示出较差的预后。KIF20A与细胞周期、凋亡等功能密切相关,在脑胶质瘤中,KIF20A高表达,下调KIF20A后,PI3K-AKT信号通路被抑制,引起细胞周期阻滞、凋亡。KIF20A抗体在晚期胰腺癌中展现出较好的疗效,目前已经进入临床Ⅱ期研究阶段。以往的研究证明,KIF20A的表达与肿瘤的发生发展及预后密切相关,但KIF20A在软组织肉瘤中的表达及作用仍不清楚。基于以上背景,我们采用WGCNA的方法筛选出与软组织肉瘤发生发展密切相关的核心基因KIF20A。纤维肉瘤是软组织肉瘤中最常见的一个组织学类型。在体外实验中,以KIF20A敲低的纤维肉瘤细胞作为研究对象,通过转录组测序检测KIF20A对纤维肉瘤细胞基因表达的影响;通过CCK-8、流式细胞术、Western blot及克隆形成实验检测KIF20A对细胞增殖的影响;通过流式细胞术和Western blot检测KIF20A对细胞凋亡的影响;通过划痕、Transwell迁移和侵袭实验检测KIF20A对细胞迁移侵袭能力的影响;通过Western blot对相关的分子机制进行研究;在体内实验中,用KIF20A敲低的纤维肉瘤细胞构建荷瘤鼠,通过记录肿瘤大小及重量检测KIF20A对肿瘤生长的影响,通过Ki67免疫组织化学染色检测KIF20A对增殖的影响,并通过小动物成像和HE染色检测KIF20A对肿瘤转移的影响。本研究的研究内容包括以下几个方面:一、软组织肉瘤的生物信息学分析为明确与软组织肉瘤发生发展相关基因,我们基于基因表达数据,利用WGCNA的方法,构建了基因共表达网络。通过网络结构和功能分析,我们筛选出处于网络中心位置并且与预后高度相关的四个核心基因（RRM2、BUB1B、CENPF、KIF20A）。二、核心基因在纤维肉瘤中的表达情况分析为明确核心基因在纤维肉瘤中的表达,我们通过RT-qPCR及Western blot对人纤维肉瘤细胞系HT-1080中核心基因的表达情况进行检测,发现KIF20A在基因水平和蛋白水平均显著高于对照细胞系。在接下来的实验中,我们以KIF20A为目标基因,对其在纤维肉瘤的作用及机制进行深入探究。三、KIF20A对人纤维肉瘤细胞基因表达的影响为探究KIF20A对人纤维肉瘤细胞基因表达的影响,我们构建了低表达KIF20A的HT-1080细胞系并对其进行转录组测序。结果发现,KIF20A基因敲低后,共有792个基因的表达发生显著变化,细胞程序性死亡、凋亡过程、对有机物反应（化疗药物等）、细胞核分裂等生物学过程及PI3K-AKT、mTOR、p53、MAPK、细胞周期等信号通路受到影响。这些结果提示,KIF20A可能通过PI3K-AKT、mTOR、p53、MAPK等信号通路影响人纤维肉瘤的发生发展。四、KIF20A在人纤维肉瘤中的作用及机制研究1、我们以KIF20A敲低的HT-1080细胞系及对照细胞系为研究对象,检测其细胞周期、细胞活力、克隆形成能力的变化。结果显示KIF20A下调后,细胞周期阻滞在G2/M期,p21Waf/Cip1表达上调,Cyclin A2、Cyclin E1表达下调,细胞活力明显下降,克隆形成能力明显降低,提示下调KIF20A可抑制HT-1080细胞的增殖。2、在凋亡实验中,KIF20A敲低后,凋亡明显增加,Bcl-2表达下调,Bax、Cleaved Caspase 9、Cleaved Caspase 3表达上调,提示下调KIF20A可促进HT-1080细胞的凋亡。3、在细胞迁移和侵袭实验中,发现KIF20A敲低后迁移及侵袭能力显著降低,提示下调KIF20A可抑制HT-1080细胞的迁移与侵袭。4、我们以KIF20A敲低的HT-1080细胞系及对照细胞系构建荷瘤鼠,测量其肿瘤大小及转移情况,结果显示KIF20A敲低后肿瘤显著减小,肿瘤组织Ki67的表达降低,肝转移发生率降低,提示下调KIF20A可抑制纤维肉瘤的生长和转移。5、为探究下调KIF20A抑制人纤维肉瘤发生发展的机制,我们检测了PI3K-AKT信号通路、NF-κB信号通路相关蛋白的变化,发现下调KIF20A后,PI3K-AKT信号通路中的p-PI3KTyr453及p-AKTSer473表达降低;NF-κB信号通路中的p-IKKα/β、p-p65表达降低。这些结果提示KIF20A敲低后,PI3K-AKT信号通路被抑制,其下游NF-κB信号通路也受到抑制。五、Kif20a在小鼠纤维肉瘤中的作用研究为明确Kif20a在小鼠纤维肉瘤中的作用,我们首先检测了其在小鼠纤维肉瘤细胞系WEHI164、MCA101、MCA207中的表达情况,发现Kif20a高表达。通过转染成功构建出Kif20a敲低的小鼠纤维肉瘤细胞系,并以此为研究对象,检测其细胞增殖、凋亡、侵袭、迁移的变化,并用Kif20a敲低的小鼠纤维肉瘤细胞系构建荷瘤鼠,观察其肿瘤大小及肿瘤转移情况,结果显示,Kif20a下调后,小鼠纤维肉瘤细胞的活力降低,细胞周期阻滞在G2/M期,克隆形成能力明显降低,凋亡增加,侵袭、迁移能力降低,肿瘤减小,肿瘤组织Ki67的表达降低,提示在小鼠纤维肉瘤中,Kif20a下调仍能抑制细胞增殖、迁移和侵袭,促进细胞凋亡,抑制肿瘤生长。综上所述,本研究显示KIF20A是软组织肉瘤生物调控网络的核心基因,KIF20A在软组织肉瘤中高表达与软组织肉瘤的预后密切相关。在纤维肉瘤细胞系中,转录组测序发现下调KIF20A,多种与生物学进程及信号通路相关的基因发生变化。进一步研究发现,下调KIF20A后,PI3K-AKT活性受到抑制,其下游NF-κB、细胞周期、凋亡等信号通路也发生改变,从而抑制了肿瘤的增殖、迁移、侵袭及转移,促进了肿瘤的凋亡。本研究明确了KIF20A在纤维肉瘤中的表达情况,探讨了其在纤维肉瘤中的作用及相关机制,提示KIF20A是治疗纤维肉瘤潜在的分子标志物和治疗靶点,为纤维肉瘤的治疗提供新的思路。