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目的：构建重组人血清白蛋白粒细胞集落刺激因子(pPIC9K-HSA-hG-CSF)表达载体,用电转化方法将线性化重组表达载体质粒pPIC9K-HSA-hG-CSF转化整合入毕赤酵母宿主菌SMD1168中,甲醇诱导表达出具有生物活性的融合蛋白,对转化子进行Western-blot检测,用小鼠骨髓白血病细胞(NFS-60)细胞检测其生物学活性。 方法：PCR扩增出人血清白蛋白基因(HSA)和粒细胞集落刺激因子基因(hG-CSF),GGGGS作为小肽接头,采用重叠PCR的方法将HSA和hG-CSF拼接起来,与质粒载体pPIC9K连接,转化大肠杆菌感受态细胞DH-5α。抽提质粒,用SalI酶切重组质粒,电转化法导入毕赤酵母SMD1168中,通过表型筛选和诱导表达实验得到蛋白表达工程菌。将阳性转化子进行PCR鉴定和Mut表型鉴定并用甲醇诱导表达,将表达上清进行Western-Blot鉴定，NFS-60细胞测活实验测定其体外生物学活性。在摇瓶培养条件下,初步研究了甲醇诱导浓度及菌体诱导起始OD600值两因素对转化子表达水平的影响。 结果：通过PCR扩增技术成功获得HSA-hG-CSF基因,经测序验证结果正确。通过电转化方法成功将酶切线性化重组表达质粒DNA整合入宿主菌基因组,并在甲醇诱导下成功表达出融合蛋白。在摇瓶培养试验条件下,通过对甲醇诱导浓度及诱导起始OD600值两因素对转化子表达水平的影响发现:在0.5％～4.0％的范围,随着甲醇诱导浓度的升高蛋白表达量也升高,在其他因素固定时,菌体诱导起始OD600值在5～60的范围内,随着OD600值的升高表达量下降。Western-blot分析表明融合蛋白具有粒细胞集落刺激因子免疫原性。NFS-60细胞测活实验分析表明体外活性达到约4.0×107IU/mg。 结论：成功制备了pPIC9K-HSA-hG-CSF表达载体,该表达载体携带的HSA-hG-CSF可以在毕赤酵母SMD1168表达出目的融合蛋白;表达的融合蛋白经过免疫学分析和测活试验表明通过本次研究成功表达出长效白蛋白融合的人粒细胞集落刺激因子,为今后的药物研发提供了重要的理论参考依据。