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背景和目的根据GLOBOCAN 2018统计数据,目前全球范围内癌症发病率和死亡率依然处于迅速增长阶段。无论是从发病率还是死亡率来看,肝癌都高居榜首,分别达到84万人、78万人。肝癌的发生和众多因素有关,包括乙型肝炎,丙型肝炎,酒精滥用等。众所周知,乙醇已被归类为致癌物质,其代谢产物乙醛是一种极具危险性物质。在乙醛代谢过程中,乙醛脱氢酶2(ALDH2)发挥着重要的作用。它能够将乙醛代谢为乙酸盐,乙酸盐经肠道排出体外,从而消除乙醛的毒性作用。rs671是ALDH2中最常见的突变位点,rs671位点的突变可以显著降低ALDH2的活性,从而减弱其代谢酒精的能力。其突变类型又细分为ALDH2杂合突变(ALDH2*1/*2)和纯合突变类型(ALDH2*2/*2),分别使其酶活降低至45%和5%。根据现有报道,ALDH2基因突变和肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma cell,HCC)关系仍存在争议。慢性重度饮酒是导致HCC发病的最重要的环境因素之一。而ALDH2基因的突变与环境风险因素相互作用后,能够明显增加HCC的发病。据报道,ALDH2基因在东亚人群中的突变率较高。但是,ALDH2*2与肝癌风险之间的机制仍不清楚。本课题主要目的是阐明ALDH2的遗传多态性在肝癌发生中的意义,并通过修复ALDH2基因突变、筛选小分子激活剂增加ALDH2的活性,抑制肝癌细胞的增殖,为临床HCC患者的防治提供一定的实验依据和理论基础。材料和方法一、ALDH2的功能研究分析1.检测ALDH2基因的蛋白表达及活性测定:(1)Western blot检测正常小鼠各组织中ALDH2的表达情况(2)运用免疫组化的方法检测肝癌组织芯片中ALDH2的表达(3)ALDH2酶活性试剂盒检测组织中ALDH2和ALDH2*2的酶活性(4)Western blot,RT-PCR实验分析ALDH2蛋白表达和mRNA表达。2.检测ALDH2对肝癌细胞生长的影响:(1)运用基因编辑系统分别敲除及过表达ALDH2基因并利用Western blot检测敲除及过表达效率(2)利用细胞增殖,克隆形成实验检测敲除ALDH2以及过表达野生型ALDH2及突变型ALDH2对肝癌细胞生长的影响(3)流式细胞仪检测过表达野生型ALDH2以及突变型ALDH2对肝癌细胞凋亡的影响。3.验证ALDH2在酒精代谢中的作用:(1)运用ALDH2酶活性检测试剂盒分析不同浓度的酒精对肝癌细胞ALDH2酶活性的影响(2)利用细胞增殖,软琼脂克隆形成实验检测敲除ALDH2,过表达野生型ALDH2以及纯和突变型ALDH2*2对酒精代谢的影响。4.研究ALDH2作用通路及机制:(1)运用共聚焦显微镜检测过表达野生型ALDH2以及纯和突变型ALDH2*2后,细胞内ROS水平以及线粒体膜电位的变化(2)Western blot检测JNK调控相关线粒体凋亡信号以及转录因子STAT3的表达。二、对ALDH2点突变进行修复1.运用CRISPR-cas9技术先进行基因敲除,然后给与HDR模板,进行重组修复。通过基因测序分析其修复效率。2.运用酶活性试剂盒检测修复后细胞内ALDH2的活性。3.运用细胞增殖试验,克隆形成试验检测修复后Huh-1细胞的增殖能力以及代谢酒精的能力。三、筛选ALDH2的小分子激活剂1.筛选ALDH2的小分子激活剂:(1)运用计算机模拟方法,得到几个备选的化合物,进行筛选,最后得到候选物并验证化合物作用。2.检测激活剂与ALDH2活性的关系:(1)利用ALDH2酶活力试剂盒检测不同时间激活剂处理细胞后,ALDH2酶活性的变化(2)激活剂处理细胞后,用western blot和RT-PCR检测ALDH2蛋白和mRNA水平的变化。3.激活剂对肝癌细胞生长的影响:(1)细胞增殖,克隆形成实验检测激活剂对肝癌细胞增殖的作用(2)流式细胞术检测该化合物对细胞凋亡,周期的影响。4.研究激活剂通过增强ALDH2的活性抑制肝癌增殖的相关作用机制:(1)运用共聚焦显微镜检测激活剂对肝癌细胞内ROS水平以及线粒体膜电位的影响(2)Western blot检测MAPK信号通路,以及相关凋亡信号通路变化。结果一、ALDH2功能研究分析1.ALDH2在正常肝组织中高表达,ALDH2在肝癌组织和细胞中低表达。2.过表达ALDH2能够抑制肝癌细胞的增殖并激活线粒体凋亡通路。3.过表达ALDH2能够激活JNK信号通路并下调STAT3的转录水平,通过调控ROS的产生促进肝癌细胞的凋亡。二、对ALDH2点突变进行修复1.通过修复ALDH2的突变能够恢复其酶活性,进而抑制肝癌细胞的增殖。三、筛选可以作为ALDH2激活剂的小分子化合物1.Butein作为ALDH2的激活剂能够抑制肝癌细胞的增殖。2.Butein可以显著增加ALDH2的RNA水平,并增加其蛋白水平和酶活力。3.Butein能够激活ALDH2相关的ROS调节的JNK信号通路并下调转录因子STAT3的表达。结论1.ALDH2在肝癌组织和细胞中低表达,过表达ALDH2能够通过增强ROS水平抑制肝癌细胞的增殖同时促进其凋亡。2.ALDH2突变降低其酶活性,明显增加酒精性相关肝癌的风险。3.Butein作为ALDH2的激活剂,上调ALDH2的表达,抑制肝癌细胞的增殖。