目的:胃癌是世界上第五大常见的癌症,也是癌症相关死亡的第三大主要原因。在2018年,胃癌导致782,685人死亡。由于缺乏有效的早期诊断标记,大多数胃癌患者在诊断时已经显示为晚期。化疗作为治疗癌症的主要方法之一,已被广泛用于晚期胃癌。传统观念认为化疗药通过直接的细胞抑制/细胞毒性作用杀死肿瘤细胞,然而,越来越多的研究结果显示化疗药不仅能发挥直接的细胞毒性作用,而且能影响宿主的抗肿瘤免疫反应。大量研究结果表明,一些化学治疗药物具有免疫原性,能通过以下方式增强抗肿瘤免疫反应:(1)上调MHCⅠ型分子,促进抗原呈递和抗原识别;(2)引起免疫原性细胞死亡(ICD);(3)增加效应T细胞的数量;(4)减少免疫抑制细胞,包括MDSC,Treg细胞和肿瘤相关巨噬细胞(TAM);(5)调节细胞因子的分泌。近年来,许多研究在关注化疗药的免疫刺激作用的同时也注意到一些化疗药物的免疫抑制作用。多项研究表明,化疗药主要从以下几个方面减弱抗肿瘤免疫反应:(1)减少循环免疫细胞;(2)诱导免疫抑制性单核细胞;(3)通过上调肿瘤细胞表面程序性细胞死亡配体1(PD-L1)促进肿瘤细胞免疫逃逸;(4)诱导肿瘤细胞分泌细胞外囊泡(EV)促进肿瘤转移。其中,PD-L1是在多种肿瘤细胞中表达的免疫共抑制分子,肿瘤细胞通过PD-L1与活化的T细胞表面的PD-1结合,在逃避宿主的抗肿瘤免疫反应中起关键作用。目前有多项研究的结果显示化疗药或者化疗方案治疗能上调肿瘤细胞PD-L1表达,例如顺铂能上调头颈鳞状细胞癌肿瘤细胞表达PD-L1,5-氟尿嘧啶(5-FU)或FOLFOX上调结直肠癌肿瘤细胞表面的PD-L1,吉西他滨在治疗前5天内上调PD-L1,紫杉醇上调乳腺癌细胞PD-L1表达。外泌体(Exosome)包含各种生物活性分子,在细胞间通讯中起关键作用,能对细胞的生理功能产生重要影响。此外,肿瘤细胞来源的外泌体能将其DNA,RNA和蛋白质转运到局部或全身,促进肿瘤的发展和转移。多项研究表明PD-L1不仅有细胞膜表面型(Membrane PD-L1),还具有细胞释放到细胞外的游离型PD-L1,游离型PD-L1主要包括可溶型PD-L1(Soluble PD-L1)和外泌体型PD-L1(Exosomal PD-L1)。此外,Mauro等人的研究结果证实肿瘤细胞来源的外泌体携带PD-L1能转运至淋巴结,造成局部和/或全身免疫抑制,从而促进肿瘤进展。我们研究团队已发表的研究结果表明,Exosomal PD-L1比Soluble PD-L1更稳定,并且可能具有更强的免疫抑制活性。5-FU作为晚期胃癌化疗的核心用药,是否能上调胃癌细胞表达Exosomal PD-L1,从而引起晚期胃癌患者免疫抑制目前尚不清楚。本研究旨在通过体外实验和临床患者血样探讨5-FU对Exosomal PD-L1,甚至对晚期胃癌患者免疫状态的作用及其机制。另外对5-FU上调PD-L1的机制进行了深入探讨,研究结果将为了解5-FU的免疫调节作用和完善临床治疗提供科学依据。研究方法:1、Western Blot检测PD-L1、CD9、CD63、Cbl-b、STAT4、p-STAT4、STAT5a、p-STAT5和GAPDH蛋白的表达。2、流式细胞术检测细胞膜表面PD-L1、CD69和CD25的表达。3、差速离心法提取胃癌细胞上清中的Exosomes,外泌体试剂盒提取胃癌患者血浆Exosomes。4、ELISA法检测soluble PD-L1和Exosomal PD-L1的表达水平。5、透射电镜法观察Exosomes的超微结构。6、Nanosight纳米颗粒跟踪分析技术测定Exosomes的直径大小。7、液态芯片检测患者血浆中细胞因子的浓度。8、流式细胞术检测Jurkat T细胞凋亡。9、提取健康人PBMC。10、利用慢病毒构建靶向沉默PD-L1和Cbl-b基因的慢病毒表达载体,建立稳定转染的胃癌细胞系。11、采用Lipofectamine 2000试剂瞬时转染STAT5a和Cbl-b的siRNA至胃癌细胞中。12、利用RT-PCR检测miR-940的表达情况。13、通过免疫共沉淀技术检测Cbl-b和STAT5a的结合。14、从TCGA网站和GEO网站分别下载TCGA-STAD和GSE62254数据集中患者的RNA测序数据进行基因相关性分析。15、统计学处理:每次实验进行3次独立重复,实验数据以均值±标准差表示。文章涉及的t检验,Spearman秩相关检验,单因素方差分析或双因素方差分析均使用SPSS 16.0统计软件进行,认定P<0.05有统计学意义。结果:1、5-FU以剂量和时间依赖方式上调胃癌细胞表达PD-L1,Membrane PD-L1和Soluble PD-L1。用不同浓度5-FU(0,0.1,1.0μg/ml)处理PD-L1高表达胃癌细胞系MKN74和PD-L1低表达胃癌细胞系MGC803,检测不同形式的PD-L1的表达水平。Western Blot检测结果发现,与未处理组相比,5-FU处理后,MKN74和MGC803表达PD-L1显著升高。流式细胞术检测结果显示5-FU处理后,MKN74和MGC803表达Membrane PD-L1显著升高。ELISA检测结果显示5-FU处理后,MKN74和MGC803表达Soluble PD-L1显著升高。这些结果提示5-FU能上调胃癌细胞表达PD-L1。2、5-FU上调胃癌细胞来源的Exosomal PD-L1。差速离心法提取MKN74来源的外泌体,经透射电镜观察双层膜结构,Nanosight纳米颗粒分析系统检测囊泡直径大小,流式细胞术和Western Blot检测外泌体标志物CD9和CD63阳性证实所提取的囊泡是外泌体。不同浓度5-FU(0,0.1,1.0μg/ml)处理胃癌细胞MKN74 48 h或72 h,用Western Blot检测了Exosomal PD-L1的表达。结果显示,与未处理组相比,5-FU处理后MKN74来源Exosomal PD-L1显著升高.这些结果提示5-FU上调胃癌细胞来源的Exosomal PD-L1。3、Exosomal PD-L1促进Jurkat T细胞凋亡。构建了稳定敲除PD-L1的MKN74/shPD-L1与对照组MKN74/NC细胞,分别提取MKN74/shPD-L1与对照组MKN74/NC细胞来源的外泌体,作用于活化的Jurkat T细胞,流式细胞术检测Jurket T细胞的凋亡。结果显示MKN74/NC细胞来源的外泌体诱导Jurkat T细胞凋亡明显高于MKN74/shPD-L1来源的外泌体。这些结果提示,Exosomal PD-L1促进Jurkat T细胞凋亡。4、Exosomal PD-L1显著抑制T细胞早期活化标志物CD69,但抑制晚期活化标志物CD25不明显。将MKN74/shPD-L1与对照组MKN74/NC细胞来源的外泌体作用于PBMC,流式细胞术检测淋巴细胞活化标志物CD69和CD25的表达。结果显示相对于未处理的活化PBMC,MKN74/NC细胞来源的外泌体处理组下调T细胞早期活化标志物CD69比MKN74/shPD-L1细胞来源的外泌体处理组下调明显。加入PD-1抑制剂纳武单抗后,MKN74/NC细胞来源的外泌体下调CD69被部分逆转。另外,结果显示相对于未处理的活化PBMC,MKN74/shPD-L1和MKN74/NC细胞来源的外泌体处理组下调T细胞晚期活化标志物CD25不明显。这些结果提示,Exosomal PD-L1显著抑制T细胞早期活化标志物CD69,但Exosomal PD-L1抑制T细胞晚期活化标志物CD25不明显。5、氟尿嘧啶上调胃癌患者外周血Exosomal PD-L1,但不具有时间依赖性。我们从接受氟嘧啶单药多周期化疗的21例Ⅲ-Ⅳ期胃癌患者获得在基线和不同化疗周期后的血液样本。用外泌体分离试剂盒提取血浆样品中的外泌体,ELISA检测Exosomal PD-L1。结果显示,与基线水平相比,患者在接受氟尿嘧啶化疗2周期和4周期后Exosomal PD-L1上调(N=21,P=0.009;N=10,P=0.047)。接受6周期化疗的只有3名患者,结果显示相比基线水平,化疗6周期后Exosomal PD-L1上调(N=3,P=0.023)。这些结果提示,氟尿嘧啶上调胃癌患者外周血Exosomal PD-L1,但不具有时间依赖性。6、氟尿嘧啶化疗2周期后抑制激活型细胞因子IL-2、IFN-γ、GM-CSF、TNF-α和IL-6,但化疗4周期和6周期后抑制不明显。液态芯片检测21例患者在基线和化疗不同周期后8个细胞因子的水平变化,结果显示化疗2周期后,激活型细胞因子IL-2、IFN-γ、GM-CSF、TNF-α和IL-6显著减少(P=0.009,P=0.014,P=0.014,P=0.004,P=0.031),激活型细胞因子IL-4、IL-8和抑制性细胞因子IL-10无明显变化。另外,在化疗4周期和6周期后8个细胞因子相比基线水平无明显变化。这些结果提示氟尿嘧啶化疗2周期后抑制激活型细胞因子IL-2、IFN-γ、GM-CSF、TNF-α和IL-6,但化疗4周期和6周期后抑制不明显。7、氟尿嘧啶化疗无效组Exosomal PD-L1显著增加,T细胞亚群数量和8个细胞因子无明显变化。在中国医科大学附属第一医院医院信息系统(HIS)中查询21例患者在化疗不同周期后基于影像学的疗效评价。根据客观缓解率,我们将疗效评价为完全缓解和部分缓解的患者作为有反应组,将疾病稳定和疾病进展的患者作为无反应组。经整理分析后,结果显示相比于有反应组化疗后Exosomal PD-L1不变甚至减少,无反应组化疗后Exosomal PD-L1明显增加(P=0.018)。另外,CD4~+T细胞和CD8~+T细胞绝对计数在化疗后的变化在有反应组和无反应组无明显差异(P=0.1025,P=0.6689)。8个细胞因子在化疗后的变化在有反应组和无反应组无明显差异。8、5-FU通过上调转录因子STAT5a促进PD-L1表达。Western blot检测用1.0μg/ml 5-FU处理MKN74和MGC803 6 h和12 h后,STAT5a的表达及其磷酸化水平。结果显示与对照组相比,STAT5a及其磷酸化水平明显上调。Western blot检测用小干扰RNA(siRNA)敲除MKN74和MGC803中STAT5a后,PD-L1表达水平的变化。结果显示,相比于对照组,MKN74/siSTAT5a和MGC803/siSTAT5a细胞表达PD-L1减少。这些结果提示,5-FU通过上调和活化STAT5a促进PD-L1表达。9、5-FU通过抑制Cbl-b促进STAT5a和PD-L1表达。免疫共沉淀实验结果表明Cbl-b能直接与STAT5a结合。用siRNA沉默MGC803的Cbl-b,然后用1.0μg/ml5-FU处理72 h,Western blot检测Cbl-b,STAT5a和PD-L1的表达。结果显示5-FU处理MGC803后Cbl-b表达下调,而沉默Cbl-b会增加5-FU诱导的STAT5a和PD-L1的上调。这些结果表明Cbl-b能直接结合STAT5a并通过增加STAT5a的泛素化而抑制其表达,而5-FU通过抑制Cbl-b上调STAT5a和PD-L1表达。10、5-FU通过上调miR-940而抑制Cbl-b,促进STAT5a和PD-L1表达。Blast对比分析结果显示Cbl-b转录本的3’UTR中存在miR-940的结合位点。RT-PCR检测结果显示MGC803经5-FU处理后,miR-940明显上调。MGC803细胞转染miR-940mimics或NC后,Western blot检测结果显示相对于对照组,MGC803转染miR-940mimics后Cbl-b表达下调,而STAT5a和PD-L1表达上调。接下来,给MGC803细胞转染miR-940 mimics的同时用1.0μg/ml 5-FU处理MGC803 72 h。Western blot检测结果表明,相比于5-FU处理后的MGC803/NC细胞,MGC803转染miR-940mimics表达后Cbl-b下调更加明显,而表达STAT5a和PD-L1上调更加明显。这些结果提示5-FU通过上调miR-940抑制Cbl-b的表达,促进STAT5a和PD-L1的表达上调。结论:1、5-FU以时间和剂量依赖的方式上调Exosomal PD-L1的表达。2、胃癌细胞来源的Exosomal PD-L1促进T细胞凋亡,抑制T细胞活化。3、氟尿嘧啶免疫抑制作用的发挥主要是通过增加循环血Exosomal PD-L1,同时伴有免疫激活型细胞因子抑制。4、5-FU能通过miR-940/Cbl-b/STAT5a轴上调PD-L1的表达。