背景皮瓣手术是整形重建和口腔颌面部手术中最重要的技术之一。然而,无论是在实验还是临床中,外科皮瓣坏死都是很难完全预防和避免的。皮瓣坏死往往导致皮瓣摘除。很多的研究都尝试通过药物,提高皮瓣成活率。然而,在这些研究中也有明显的一些不足。许多研究中没有动物模型解剖学证据；当坏死即将发生时,没有很好的解决方法；虽然一直对坏死的预防性研究很多,但关于促进坏死修复的研究很少,对皮瓣坏死创口治疗的研究更为鲜见。KGF、EGF和VEGF是生长因子领域研究最多的几个生长因子,大量的文献都确定其分别特异性对上皮细胞、主要对上皮细胞、特异性对血管内皮细胞有很强的生长促进作用。KGF对上皮细胞的特异性作用,使其能促进上皮细胞增殖的同时,不促进纤维生长,不导致疤痕形成,成为促进上皮创口愈合最好的候选。EGF是临床上应用最多的生长因子之一,其对上皮的促进作用得到很多患者及医生的认同。VEGF是迄今为止发现的促进血管新生最有效的生长因子,能够极大地提高外科皮瓣的成活,预防皮瓣坏死。皮瓣坏死的基因预防及治疗是一种极有潜力的方法,是未来研究的发展方向。当今皮瓣的基因研究主要是以生长因子作为治疗性基因完成的。如何以最佳的方法将外源性DNA导入皮瓣,使细胞接收并表达外源DNA,一直是值得大家研究和探讨的问题。我们以腺病毒为载体(Ad),携带角化细胞生长因子(KGF)基因的方法,利用复制缺陷型腺病毒载体重组KGF基因,通过其强感染能力与转基因能力,在体外体内特异性表达有活性的KGF蛋白,发挥定向修复组织损伤的作用。另外我们直接在大鼠背部的坏死皮瓣区域中和皮肤中注入EGF和VEGF,观察联合应用生长因子是否会对皮瓣区坏死愈合起作用。方法1.Pac Ⅰ核酸内切酶酶切鉴定腺病毒质粒,测序检测是否质粒存在变异。Pac Ⅰ核酸内切酶酶切pAd-KGF,线性化后的pAd-KGF转染进HEK293(293)细胞后,制备Ad-KGF。应用293细胞扩增、纯化得到Ad-KGF病毒。应用于后续细胞及动物实验,并观察病毒转染293细胞后,细胞形态及病毒的感染能力。2.Ad-KGF感染正常细胞系PA317,HUVEC,HaCaT,和293细胞后,观察病毒的感染的能力；提取受感染细胞的RNA,逆转录得到cDNA后,进行半定量PCR和荧光定量PCR,检测细胞内KGF的表达水平；通过ELISA,检测受感染细胞上清中KGF的表达水平；通过划痕实验模仿伤口,培养HaCaT细胞48小时,确定KGF对上皮细胞生长迁移的作用；将PA317细胞,HUVEC细胞和HaCaT细胞接种于Transwell小室,293细胞+Ad-KGF转染24小时(293+Ad-KGF),293细胞+Ad转染24小时(293+Ad),HaCaT,293细胞和293细胞+KGF(293+KGF)接种于下室内,观察KGF和Ad-KGF对成纤维细胞系,血管内皮细胞系和上皮细胞系的生长迁移作用。3.我们首先解剖大鼠背部,研究确定大鼠背部血管走行。在传统大鼠背部皮瓣模型上,改良手术及实验过程,使皮瓣发生坏死。记录大鼠的体重,皮瓣坏死面积和愈合情况。在术后第15天,25天,和45天过量水合氯醛处死大鼠,取背部坏死皮瓣标本,进行组织化学染色分析。4.在建立大鼠背部皮瓣模型之后,所有动物分为四组。将1ml PBS+dexamethasone(DXM),1ml PBS+Ad-KGF+DXM,or1ml PBS+Ad+DXM分别注入大鼠背部皮瓣坏死区皮下和创口边缘,分别于术后5天,10天,20天,和30天注射相同的药物。隔日记录体重,直至创面坏死愈合。术后第15天,25天,和35天过量水合氯醛处死大鼠,取背部坏死皮瓣标本,进行组织化学Masson染色、免疫组化染色分析和荧光定量PCR分析,上皮及上皮下组织的生长情况,上皮的生长厚度,取血清进行ELISA检测KGF表达水平。5.首先通过细胞迁移实验确定EGF和VEGF对PA317,HUVEC,和HaCaT细胞迁移的活性。建立大鼠背部皮瓣模型,坏死发生后,沿创口边缘及坏死皮下注入1ml PBS+EGF (150mg/kg),1ml PBS+VEGF (10μg), or1ml PBS+EGF (150μg/kg)+VEGF(10μg)。隔日记录体重并注射相同的药物,直至创面坏死愈合。术后第15天和25天过量水合氯醛处死大鼠,取背部坏死皮瓣标本,进行组织化学Masson染色和免疫组化染色分析创缘上皮及上皮下组织的生长情况,上皮的生长厚度,并取血清进行ELISA检测。结果1.酶切鉴定结果与设计和文献相符,证明载体pAd-KGF构建正确。pAd-KGF质粒测序结果显示起始位点：第185bp,ATG。终结位点：第679bp,TAA。全序列对比小鼠KGF基因序列,二者完全匹配,不存在突变。病毒转染正常293细胞24小时,开始出现细胞变圆；荧光显微镜镜下观察,部分293细胞开始表达大量荧光蛋白。转染第96小时后,所有293产生细胞病理效应,显微镜下观察所有细胞呈圆球形葡萄样改变,漂浮于培养液中,荧光显微镜镜下观察293细胞呈圆球形,表达大量荧光蛋白。重组腺病毒Ad-KGF和Ad在293细胞内大量扩增,并收集后。测得Ad-KGF病毒的效价滴度为2×1011PFU/ml,Ad病毒的效价滴度为3×1012PFU/ml。2.pAd-KGF为构建腺病毒质粒。半定量PCR证明pAd-KG内存在KGF表达基因。经过基因重组后的腺病毒Ad-KGF具有感染正常细胞,于正常细胞内表达KGF的能力。正常的293细胞不能表达KGF的mRNA,PA317细胞能分泌KGF,表达KGF mRNA。Ad-KGF感染293细胞后,细胞成功表达KGF mRNA,而在293细胞和293+空病毒Ad内不能表达KGF mRNA。通过ELISA检测培养液上清中外分泌的KGF含量。检测证明Ad空病毒转染细胞后48小时,上清液中不分泌KGF蛋白,而Ad-KGF转染细胞的后的48小时,细胞培养上清中能够检测到大量的KGF表达,且浓度随着Ad-KGF的滴度增加而增加。通过划痕实验,证明在KGF作用下,HaCaT上皮细胞的迁移能力显著增加。而对照组细胞开始出现凋亡现象。Transwell细胞迁移实验证明KGF能有效促进HaCaT上皮细胞生长迁移,而对HUVEC血管内皮细胞作用不明显,对PA317成纤维细胞没有明显作用。3.大鼠背部七条静脉和一侧有超过二十条动脉分布。手术后三天,大鼠的体重会稍有下降,然后稳定上升。PBS组和空白组中坏死面积在9天内达到最高峰。从9至47天中,坏死面积逐渐减少,在47天坏死几乎完全愈合。组织病理检查中,可见术后15天,坏死创口边缘上皮细胞增生明显,有少量纤维成分生成,创口愈合区有大量小脉管形成和大量不成熟的纤维成分形成。至第35天,上皮增生修复较前明显弱,但较正常上皮,厚度仍明显增大。4.成功建立大鼠背部皮瓣坏死模型后,四组动物术后体重均有轻度下降,从第三天开始,体重逐步上升,其中以DXM组的体重上升最明显。术后第五天,坏死成活区域分界清晰。术后第十天,坏死面积达到最大。随着不同药物的治疗,坏死面积在各组间都明显下降,且Ad-KGF组坏死面积缩小最为明显。Masson染色显示术后15天,四组坏死创口边缘上皮都明显增生,其中Ad-KGF组上皮细胞增生最多。术后35天,Ad-KGF组坏死伤口已经愈合,而其它三组还有较大的坏死面积。术后15天和25天,上皮细胞厚度在Ad-KGF组增生最为明显,术后35天上皮厚度与其它组间没有大的差异。免疫组织化学分析显示,只有在Ad-KGF组的上皮和间充质细胞中有强阳性的KGF表达,而其它三组均为阴性。Anti-CD34免疫组织化学染色显示四组的小血管生成数目相当5.PA317在EGF, VEGF, VEGF+EGF,或PA317作用下,没有显著性的生长差异。HUVEC对VEGF表现出明显生长加速,在EGF和VEGF联合作用下,生长更加明显,而与PA317共培养时,也有少量生长改变。HaCaT细胞在EGF和VEGF+EGF联合作用下都是表现出生长迁移能力提高。建立动物模型后,分组如下:PBS, EGF, VEGF, EGF+VEGF。四组动物术后体重均有轻度下降,从第三天开始,体重逐步上升,其中以EGF组的体重上升最少。随着不同药物的治疗,坏死面积在各组间都明显下降,且VEGF+EGF组坏死面积缩小最为明显。术后15天和25天,Anti-CD34免疫组织化学染色显示EGF,VEGF和VEGF+EGF组的小微血管生成数目相当,都显著高于PBS组。结论1. pAd-KGF经过酶切鉴定和测序鉴定具有KGF完全匹配的基因组。成功构建Ad.KGF和Ad,且具有感染细胞的能力。Ad.KGF和Ad经过扩增纯化的滴度为2×1011PFU/ml和3×1012PFU/ml,可以满足细胞及大鼠皮瓣实验的要求。2. Ad-KGF和Ad可以高效转染PA317、HUVEC和HaCaT细胞,并在转染后高效表达活性KGF、KGF可有效促进HaCaT细胞生长,而对PA317、HUVEC细胞作用不明显。3.本实验在确定大鼠背部血供系统基础上,设计形成一套简便且易于推广的手术和皮瓣坏死模型流程,成功建立了稳定的大鼠背部皮瓣坏死伤口模型,可以进行皮瓣坏死为目的基因或药物实验研究。4.使用高表达KGF的腺病毒重组局部转染大鼠背部皮瓣坏死伤口,能有效促进坏死伤口的愈合。5. EGF-VEGF联合应用能促进改良大鼠背部坏死创面愈合。