论文部分内容阅读
研究背景帕金森病（Parkinson’s Disease,PD）是一种以震颤、肌强直、运动迟缓等为主要临床表现的神经性退行性疾病,多见于中老年人发病。中脑黑质致密部多巴胺（Dopamine,DA）能神经元变性丢失、神经元内出现嗜酸性路易小体（Lewy Body,LB）是其主要病理特征。流行病学调查表明,在神经系统疾病中,PD的增长最快（按照患病率,致残和死亡率）,全球目前已超过600万人,预计至2040年,该数字会再翻一倍达1200万人以上。目前我国65岁以上人群PD的患病率大约是1.7%,随着老龄化不断推进,至2030年中国PD患者将增至494万,约占全球PD患者的一半。PD发病率的增长不仅降低病人及家属的生活质量,也给社会也带来沉重的医疗及经济负担。PD的发病涉及线粒体功能障碍、神经炎症、细胞凋亡、蛋白质稳态紊乱等多种机制及相互之间的作用。诱导激酶蛋白1（PTEN-inducedkinase1,PINK1）是定于线粒体的丝氨酸/苏氨酸激酶,PINK1可调节其下游Parkin、线粒体分裂融合蛋白,协同调控线粒体的动态平衡,在维持线粒体形态结构与功能中发挥重要作用。其基因和蛋白表达异常所导致的线粒体功能障碍是PD发病的重要机制。至今还没找到治愈PD方法,目前主要的治疗仍是左旋多巴类等西药,但该类药物随时间的推移,会出现耐药性及副作用。现代中医学将PD归为“颤证”,中医药治疗PD历史悠久,中药可有效改善PD患者整体状态,其副作用小,较好地提高患者生存质量。明确其治疗的机制,为开发和推广中医药在临床更广泛的使用提供实验依据具有现实意义。我们课题组前期研究发现大补阴丸和牵正散的合方补阴牵正方（Bu-Yin-Qian-Zheng-Fang,BYQZF）可减轻PD小鼠脑线粒体以及PD细胞线粒体的损伤,保护线粒体的质量。基于此,本研究将采用PD小鼠模型,从pink1基因敲减角度进一步研究补阴牵正方对PD脑中线粒体质量控制的调控机制。研究目的揭示PD小鼠脑线粒体形态结构和功能以及脑线粒体的动态平衡变化与pink1基因的相关性,探求BYQZF是否可通过pink1基因调控PD小鼠脑线粒体动态平衡的相关分子以保护DA神经元,阐明中医药治疗PD的机制,为临床更好地运用奠定实验基础。研究方法第一章构建慢病毒（lentivirus,LVs）介导脑pink1-RNAi小鼠模型:首先构建pink1-RNAi质粒对其进行鉴定;完成慢病毒pink1-RNAi包装,并检测病毒滴度及小鼠脑pink1 mRNA和PINK1的表达。将小鼠分为3组:正常组、阴性对照病毒组和慢病毒pink1-RNAi组。2W每组取3只小鼠,取脑冰冻切片并做相应处理,荧光显微镜下观察各组小鼠左侧纹状体区慢病毒包装pink1-RNAi载体携带的绿色荧光蛋白（Green fluorescent protein,GFP）表达。4w后,每组各取3只小鼠,取脑,实时荧光定量（Quantitative Real-time,PCR）测小鼠脑pink1 mRNA 水平,蛋白质印迹法（Western Blot,WB）分别检测小鼠左、右侧脑的PINK1蛋白表达。第二章BYQZF对慢病毒介导脑pink1-RNAi PD小鼠模型的治疗作用:小鼠分6组,每组3只:阴性对照病毒组、阴性对照PD组、阴性对照PD中药组、慢病毒pink1-RNAi组、慢病毒pink1-RNAi PD组、慢病毒pink1-RNAi PD中药组。通过记录爬杆时间、悬挂得分评价各组小鼠的运动协调能力;用免疫荧光法观察各组小鼠黑质DA神经元的变化;高效液相色谱法检测各组小鼠脑DA及相关代谢产物二羟苯乙酸（dihydroxy-phenyl acetic acid,DOPAC）、高香草酸（homovanillic acid,HVA）水平。第三章BYQZF对慢病毒介导脑pink1-RNAiPD小鼠模型脑线粒体质量的影响:小鼠分组同第二章;通过透射电镜观察小鼠黑质神经元超微结构变化。荧光素酶法检测脑线粒体ATP水平、比色法测定脑线粒体呼吸链复合体Ⅰ酶活性。Western Blot检测小鼠脑PINK1和Parkin蛋白水平;检测脑线粒体融合蛋白1（Mitofusin 1,Mfn1）、融合蛋白2（Mitofusin 1,Mfn2）和视神经萎缩蛋白1（Optic atrophy 1,Opa1）水平;检测线粒体分裂动力相关蛋白1（Dynamic related protein 1,Drp1）和线粒体分裂蛋白1（Mitochondrial fission protein 1,Fis1）水平。采用免疫荧光双标技术及荧光显微镜观察:PINK1 与 Parkin、PINK1 与 Tom20 以及 Parkin 与 Tom20 的共定位。研究结果第一章结果1.慢病毒pink1-RNAi载体构建:pink1-RNAi序列与和比对序列一致,完成慢病毒pink1-RNAi包装,慢病毒滴度为5×108 TU/mL。2.小鼠脑慢病毒pink1-RNAi模型构建:荧光显微镜观察发现正常组小鼠纹状体内无GFP荧光表达,在阴性对照病毒组和慢病毒pink1-RNAi组小鼠纹状体有明显GFP荧光表达。与正常组相比,阴性对照病毒组小鼠脑内pink1 mRNA及蛋白无明显变化;与阴性对照病毒组相比,慢病毒pink1-RNAi组小鼠脑内pink1 mRNA及蛋白明显降低;且以上三组小鼠左、右侧脑的PINK1蛋白表达无差异,提示慢病毒介导小鼠脑pink1-RNAi模型构建成功。第二章结果1.各组小鼠行为学:与阴性对照病毒组相比,阴性对照PD组小鼠爬杆时间明显延长,悬挂得分降低;BYQZF干预后,可改善PD小鼠运动协调障碍;慢病毒pink1-RNAi组爬杆时间也延长,悬挂得分也降低。与慢病毒pink1-RNAi组小鼠相比,慢病毒pink1-RNAi PD组小鼠爬杆时间更长,悬挂得分更低;BYQZF干预后小鼠的行为学没有明显变化。2.各组小鼠中脑黑质TH+神经元数目:与阴性对照病毒组相比,阴性对照PD组小鼠TH+神经元数目明显减少;在BYQZF干预后,TH+神经元数目增多;慢病毒pink1-RNAi组TH+神经元数目也减少。与慢病毒pink1-RNAi组小鼠相比,慢病毒pink1-RNAi PD模型组小鼠TH+神经元数目也显著减少;中药干预后小鼠黑质TH+神经元数目没有明显增多。3.各组小鼠脑DA及其代谢产物水平含量:与阴性对照病毒组相比,慢病毒阴性PD模型组小鼠DA、DOPAC、HVA水平明显降低;在BYQZF干预后,DA、DOPAC水平明显提高;慢病毒pink1-RNAi组DA、DOPAC水平也明显降低。与慢病毒pink1-RNAi对照组相比,慢病毒pink1-RNAi PD组小鼠脑DA、DOPAC、HVA水平明显降低;BYQZF干预后以上指标没有改善。第三章结果1.各组小鼠中脑黑质神经元超微结构:与阴性对照病毒组相比,阴性对照PD组小鼠黑质神经元的超微结构损伤较明显;BYQZF干预后,可在一定程度上改善其损伤;慢病毒pink1-RNAi组小鼠黑质神经元的超微结构也受到损伤。与慢病毒pink1-RNAi组小鼠相比,慢病毒pink1-RNAi PD组小鼠脑小鼠黑质神经元的超微结构更严重;BYQZF干预后对其损伤没有明显改善。2.各组小鼠脑线粒体功能:与慢病毒阴性对照组相比,阴性对照PD组小鼠黑质脑线粒体ATP水平、呼吸链复合体Ⅰ酶活性降低;在BYQZF干预后,可改善其线粒体功能;慢病毒pink1-RNAi组小鼠脑线粒体ATP水平、复合体Ⅰ酶活性也降低。与慢病毒pink1-RNAi组小鼠相比,慢病毒pink1-RNAi PD组小鼠脑线粒体ATP水平、复合体Ⅰ酶活性更降低;BYQZF干预后对其损伤没有明显改善。3.各组小鼠脑线粒体质量相关蛋白的表达:与阴性对照病毒组相比,阴性对照PD组小鼠脑PINK1和Parkin表达降低,脑线粒体融合蛋白Mfn1、Mfn2和Opa1表达降低,脑线粒体分裂蛋白Drp1、Fis1表达增加,PINK1与Parkin、PINK1与Tom20及Parkin与Tom20的共定位系数增加;BYQZF干预后PINK1和Parkin表达增加,脑线粒体融合相关蛋白表达增加,相关分裂蛋白表达减少,PINK1与Parkin、PINK1与Tom20及Parkin与Tom20的共定位系数减少。与慢病毒pink1-RNAi组小鼠相比,慢病毒pink1-RNAi PD组小鼠PINK1和Parkin表达降低,脑线粒体融合相关蛋白表达降低,相关分裂蛋白表达增加,PINK1与Parkin、PINK1与Tom20及Parkin与Tom20的共定位系数增加;BYQZF干预后对控制线粒体质量的相关蛋白表达及和线粒体的共定位等并没有明显改善。研究结论1.4W可成功构建慢病毒介导的小鼠脑pink1低表达模型。2.本实验从反面（小鼠脑pink1基因敲减）进一步证实中药合方BYQZF可通过调控小鼠脑pink1基因达到保护中脑DA能神经元防治PD的作用。其机制可能是通过调控小鼠脑PINK1蛋白、下游Parkin以及脑线粒体分裂和融合蛋白表达,维持线粒体的动态平衡,以修复PD引起的线粒体形态结构和功能损伤。表明BYQZF治疗PD的作用机制可能与pink1有着密切的关系。这为BYQZF临床治疗PD的作用环节和机制研究提供了进一步的实验依据。