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反刍动物瘤胃内寄居着种类丰富、数量繁多的微生物,这些微生物与瘤胃壁黏膜层的上皮亲密接触,瘤胃菌群失衡最易引发疾病,目前抗生素仍是治疗动物疾病的首选药物。但随着抗生素的滥用带来的负面效应也日益突出。防御素不仅可以直接杀灭细菌、真菌和病毒等微生物,还具有调节机体的炎症反应、趋化免疫细胞和促进细胞分化等多种生物学功能,广泛参与机体对病原微生物的抗感染过程。本课题组已有研究表明酿酒酵母菌能够促进体外培养的绵羊瘤胃上皮细胞中防御素的表达。为了进一步确定酿酒酵母菌诱导防御素表达的有效成分,本试验选用酿酒酵母细胞壁探究其对绵羊瘤胃黏膜上皮细胞诱导表达防御素的效果,并进一步研究其可能诱发的信号通路,为开发预防或治疗绵羊消化道疾病的益生菌生物制品提供了强有力的理论依据。本论文主要研究的内容有以下几个方面:1.建立的SRECs(sheep rumen epithelia cells)培养体系经免疫荧光的方法鉴定,证实所培养的细胞是上皮细胞,纯度符合试验要求;用CCK-8分析细胞生长性能的试验,表明培养的SRECs符合细胞生长规律;实时无标记细胞生长仪检测结果表明第3代SRECs细胞以1.63×10~5个/mL的密度传代后培养96 h时,细胞生长状态最好。2.试验中培养的酵母菌通过PCR扩增26S序列并测序,确定试验用酵母菌为酿酒酵母菌;通过绘制酿酒酵母菌的生长曲线,确定酿酒酵母菌培养时间为12 h,此刻进入生长平台期。对刚进入平台期的酿酒酵母进行破壁,用扫描电镜观察破碎前后菌形态变化,可见菌体由球状变成片状,证实破壁成功;3.充分清洗破壁后的沉淀,并采用凯氏定氮、酸水解、高效液相色谱法等方法对所提取的细胞壁进行了成分鉴定,验证所提取的细胞壁成分符合酿酒酵母细胞壁的物质组分,可代表全细胞壁成分用于后续试验。4.诱导试验表明:SRECs表达SBD-1(sheep beta defensin-1)的水平与酿酒酵母细胞壁添加的浓度、时间均具有依赖性;添加不同浓度酵母细胞壁(0、25、50、100、200、400μg/mL)培养不同时间(0、2、4、8、12、24 h)SRECs可不同程度地增加SBD-1 mRNA的表达量;其中添加浓度为200μg/mL诱导培养12 h时效果最好,与空白对照相比差异极显著(P<0.001)。5.SRECs用TLR2抑制剂预处理后再用细胞壁诱导培养,证明了酿酒酵母细胞壁诱导SRECs中SBD-1的表达与膜受体TLR2有关。SRECs用MyD88抑制剂预处理后再用细胞壁诱导培养,证明了细胞内衔接蛋白MyD88参与了酿酒酵母细胞壁诱导SRECs表达SBD-1的过程。SRECs用NF-κB抑制剂预处理后再用细胞壁诱导培养,证明了酿酒酵母细胞壁经由NF-κB信号通路诱导SRECs中SBD-1的表达。本试验研究表明酿酒酵母细胞壁可诱导绵羊瘤胃上皮细胞内SBD-1的差异性表达,并证实了酿酒酵母细胞壁诱导绵羊瘤胃上皮细胞表达SBD-1的过程可通过TLR2-MyD88-NF-κB途径实现。