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目的:新发现的癌基因LETMD1与人多种恶性肿瘤的发生发展有关,可能是潜在的恶性肿瘤早期诊断标记物以及基因治疗的作用靶点,我们以LETMD1和肝细胞癌为研究对象,制备针对性的LETMD1多克隆及单克隆抗体,并将其应用于肝细胞癌的临床诊断和癌变机制研究,尝试建立肝细胞癌特异的组织标本诊断方法和血清ELISA诊断方法并初步探讨LETMD1在肝细胞癌发生发展过程中的作用意义,为建立特异灵敏的肝细胞癌早期诊断方法及深入研究LETMD1的生物学功能提供实验基础。
方法:1.LETMD1重组蛋白的表达及其多克隆抗体的制备:运用生物信息学软件分析预测LETMD1编码蛋白的结构及优势抗原表位,运用RT-PCR技术从肝癌细胞系HepG2扩增出目的基因,构建其原核表达载体,表达纯化LETMD1蛋白,免疫大耳白兔制备其多克隆抗体,运用硫酸铵沉淀法初步纯化多抗血清,使用细胞免疫荧光及Western blot等免疫学技术对所制备的多克隆抗体进行免疫特性鉴定。2.抗-LETMD1单克隆抗体的制备与鉴定:以表达纯化的LETMD1蛋白免疫BALB/c小鼠,PEG融合法制备抗-LETMD1单克隆抗体,运用亲和层析技术对制备的单克隆抗体进行纯化,使用细胞免疫荧光及Western blot等免疫学技术对所制备的单克隆抗体进行免疫特性鉴定。3.抗-LETMD1抗体在肝细胞癌临床诊断中的初步应用:以制备纯化的抗体为工具,运用Western blot及免疫组织化学方法检测肝癌组织中LETMD1编码产物表达情况:建立双夹心ELISA方法检测肝细胞癌患者及正常人血清中LETMD1编码产物表达情况。4.抗-LETMD1抗体在肝细胞癌变机制研究中的应用:以Western blot技术初步分析小鼠细胞模型中同源LETMD1表达情况;以定量Western blot技术检测人肝癌细胞系HepG2和HepG2.2.15中LETMD1编码产物表达情况,分析致瘤病毒HBV是否与LETMD1的表达存在相关性。
结果:1.LETMD1重组蛋白的表达及其多克隆抗体的制备:(1)成功克隆了LETMD1膜外区基因,构建了其原核表达质粒;(2)表达纯化了LETMD1蛋白,获得了高浓度的纯化蛋白;(3)以纯化蛋白作为免疫原,免疫大耳白兔,制备多克隆抗体,获得了针对LETMD1-C蛋白的含多克隆抗体的免疫血清;(4)经免疫学鉴定,制备的多克隆抗体具有较高的效价和良好的特异性。2.抗-LETMD1单克隆抗体的制备与鉴定:(1)常规PEG融合法制备单抗,获得了六株能稳定高表达LETMD1单克隆抗体的杂交瘤细胞株;(2)免疫学鉴定结果验证了LETMD1表达产物定位于肿瘤细胞胞浆及胞膜,在肝癌细胞系高表达,在正常肝细胞不表达,制备的单克隆抗体具有较高的使用效价和良好的特异性。3.抗-LETMD1抗体在肝细胞癌临床诊断中的初步应用:(1)检测肝组织标本中LETMD1编码产物表达情况,发现其在正常组织中不表达,在肝癌组织表达明显高于癌旁组织;(2)双夹心ELISA方法检测血清中LETMD1编码产物表达情况,结果显示肝癌患者血清中LETMD1编码产物表达明显高于正常对照;4.抗-LETMD1抗体在肝细胞癌变机制研究中的应用:(1)使用制备的抗体检测到小鼠肝癌细胞系有LETMD1同源体表达;(2)使用定量Western blot,检测到LETMD1编码产物的含量在表达HBV的HepG2.2.15细胞中较不表达HBV的HepG2中明显更高。
结论:1.LETMD1重组蛋白的表达及其抗体的制备与鉴定:成功构建了LETMD1膜外区表达质粒,表达纯化的蛋白具有较强的免疫原性;制备了抗-LETMD1-C的多克隆和单克隆抗体,经鉴定二者都具有较高的效价和良好的特异性,可以应用于LETMD1癌基因的功能研究和肝细胞癌的临床诊断研究;2.抗-LETMD1抗体在肝细胞癌临床诊断中的初步应用:使用制备的抗-LETMD1抗体,建立了肝细胞癌临床组织标本LETMD1蛋白的检测方法;初步建立了检测血清中LETMD1蛋白的双夹心ELISA方法;3.抗-LETMD1抗体在肝细胞癌变机制研究中的应用:发现了小鼠肝癌细胞模型中有特异的LETMD1同源体表达,使用我们制各的抗体可以检测LETMD1同源表达;初步证明了肝细胞癌主要致病因素HBV与癌基因LETMD1的表达具有相关性。