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三磷酸腺苷(adenosine 5’-triphosphate,ATP)是一种快速兴奋性神经递质,与其受体结合后参与机体多种生理及病理机制的调节过程。目前,P2X受体已被克隆出P2X1~7 7种亚型。其中,P2X7受体由于其分子结构的特殊性近年倍受关注。P2X7受体在体内组织广泛表达,与炎症、肿瘤以及多种神经系统疾病的机制有着密切关系。在疼痛相关机制的研究中发现,P2X7受体参与炎症性疼痛、神经病理性疼痛和癌性疼痛的调制机制。电针(electroacupuncture,EA)作为重要的非药物镇痛手段,广泛应用于临床并取得良好的镇痛效果。但长时间的使用外周穴位电针刺激其镇痛作用会逐渐减弱,最终引起电针耐受(electroacupuncture tolerance)。近年来研究发现,P2X受体激活参与电针镇痛及耐受机制。中脑导水管周围灰质(periaqueductal gray,PAG)为机体内源性镇痛系统的重要组成部分,尤其是其外侧区(lateral periaqueductal gray,l PAG)是疼痛信息调制和电针耐受形成、维持的关键结构,但l PAG中P2X7受体激活是否参与电针耐受的形成和维持及其相关的信号机制尚不清楚。目的:检测多次外周穴位电针刺激后大鼠痛阈和l PAG中P2X7受体蛋白表达和功能变化,求证l PAG中P2X7受体活化后参与大鼠电针耐受的形成并对其相关的胞内信号转导机制进行初步探讨。方法:本实验包括两个部分:(一)在体实验:健康雄性Sprague Dawley(SD)大鼠在外周穴位多次给予电针刺激,建立电针耐受大鼠模型;每日检测大鼠痛阈值,观察其变化规律;6 d后取各组大鼠l PAG,免疫组化、免疫印迹和免疫荧光双标法检测P2X7受体在l PAG的表达部位及表达量变化情况;对电针耐受大鼠l PAG中微量注射不同剂量P2X7受体特异性拮抗剂A-740003,观察其对大鼠痛阈和电针镇痛作用的影响。(二)离体实验:取<3 d的SD乳鼠l PAG组织,原代培养神经元细胞,激光共聚焦检测P2X7受体活化对l PAG神经元[Ca2+]i水平的影响。结果:(一)在体实验:假电针组大鼠在各观察时间点机械痛阈变化值和热痛阈变化值以及l PAG中P2X7表达量与正常组大鼠比较,差异无统计学意义(P>0.05);电针组大鼠痛阈变化值(包括机械痛阈变化值和热痛阈变化值)与正常组比较显著升高(P<0.01),随着电针刺激次数的增多其痛阈变化值逐渐下降,6次电针后趋近于正常组变化百分数值(P>0.05),提示:大鼠电针耐受形成;免疫组化、免疫印迹技术检测提示电针耐受大鼠l PAG中P2X7受体阳性细胞数和P2X7受体蛋白表达上调,与同时间点正常组大鼠比较差异有统计学意义(P<0.001);通过对电针耐受大鼠l PAG微量注射10 nmol或100 nmol A-740003后,电针耐受大鼠机械痛阈及热痛阈变化百分数值增高,A-740003可翻转电针耐受效应;免疫荧光双标法检测提示:P2X7受体与神经元特异性标记物Neu N在l PAG存在共表达,而与星形胶质细胞特异性标记物GFAP及小胶质细胞特异性标记物Iba1未见共表达。(二)离体实验:激光共聚焦技术对[Ca2+]i水平检测提示:P2X7受体激动剂Bz ATP可引起培养的l PAG神经元细胞[Ca2+]i升高;给予P2X7受体特异性拮抗剂A-740003或无钙的细胞培养液分别预孵育10 min或20 min后,Bz ATP诱发的神经元细胞[Ca2+]i升高被抑制。结论:多次外周穴位电针刺激可引起正常大鼠痛阈变化百分数降低,形成电针耐受;电针耐受大鼠l PAG中P2X7受体表达上调,功能活化,P2X7受体激活参与了大鼠电针耐受形成机制;此效应可被P2X7受体特异性拮抗剂A-740003翻转。Bz ATP激活P2X7受体后诱发l PAG神经元[Ca2+]i升高,此效应与细胞外Ca2+内流有关,可被A-740003或无钙液所抑制。