磷是植物生长和新陈代谢所需一种最重要大量元素之一,同时也是核酸、磷脂、ATP、酶、辅酶的一种关键性成分。磷(植物主要吸收磷酸盐形式的磷)缺乏是限制植物生长的第二位的大量元素,其在土壤中以复杂的、难溶的、无机和有机形式存在,不能被植物直接吸收。植物的正常生长和产量依赖于可利用性Pi (Inorganic Phosphate,磷酸盐),然而在很多自然和农业生态系统中植物经常会出现有效和可溶性磷极度缺乏的情况。为了适应磷缺乏,植物已进化获得精巧的调控机制来保持体内磷的动态平衡,包括侧根和根毛的发育、根系构型改变(例如蛋白样和胡萝卜状根的形成)、从根系分泌磷酸酶和有机酸、高低亲和性磷酸盐转运体(phosphate transporter, PT)的诱导。同时很多植物与菌根真菌形成共生关系以便获得更多的Pi。在植物中存在着很多的适应性机制以减轻或应对磷缺乏。这些机制的实现是通过几百个基因表达谱的变化来实现的。这-些感知Pi状态和调整适应机制的调节基因组成网络现在逐渐清晰。目前已鉴定的该网络组成包括转录因子、SPX (Sygl, Pho81,XPRl)亚家族蛋白、非编码RNA和蛋白修饰物(包括参与SUMO化、磷酸化、去磷酸化以及蛋白运输的各种蛋白)。本研究克隆了PT、PHR (phosphate starvation response)、SPX和Gm4等相关基因；并利用生物信息学方法研究了GmPT1和GmPT2蛋白结构；采用绿色荧光蛋白融合PT来研究GmPT1和GmPT2的亚细胞定位；在酵母突变体中研究GmPT1和GmPT2功能和生化特征；采用Real-time RT-PCR研究GmPT1合GmPT2表达模式；利用酵母单杂交的方法研究GmPHR1和GmSPX1的互作；同时,利用主成分分析和隶属函数对20种大豆基因型进行了耐低磷性状的评价。通过研究获得以下研究结果：1.根据主成分和隶属函数分析,评价供试大豆基因型耐低磷性状强弱顺序。供试基因型耐低磷由强到弱的顺序为：赶泰、五河齐黄豆、7650、湘豆4号、先进2号、苏88M-21、Peking、高作选1号、科丰一号、新沂小黑豆、南农1138-2、94-156、87-23、菏84-5、波高、RN-9.通山薄皮甲、皖82-178、湘秋豆2号、垫江早黄豆。2.克隆得到两个PT基因分别在大豆染色体Gm10(41,391,168～41,393,008)和Gm20(42,980,124～42,981,928)上,分别命名为GmPT1(登录号：HQ392508)、GmPT2(登录号：HQ392509)。GmPT1含有1841个碱基其开放阅读框编码536个氨基酸(分子量为58730.46Da)。GmPT2含有1802个碱基其开放阅读框编码536个氨基酸(分子量为58627.29Da)。GmPT1和GmPT2的开放阅读框都是从第23-1633bp,在核苷酸序列上有88.7%一致性,在氨基酸序列上有97.9%的一致性。GmPT1和GmPT2氨基酸序列与拟南芥、番茄、马铃薯和蒺藜苜蓿有着很高相似性。GmPT1和GmPT2与来自真菌的PT——菌根真菌(GvPT)以及酿酒酵母(PHO84)有着很高的一致性。GmPT1氨基酸序列与GvPT (登录号：Q00908)、PHO84(登录号：P25297)分别有76%、61%一致性；GmPT2氨基酸序列与GvPT(登录号：Q00908)、PHO84(登录号：P25297)分别有76%、63%一致性。GmPT1和GmPT2(?)勺疏水性分析表明这两个转运体均有12个跨膜区域(TM, transmembrane),这是PT的共同特征,与PT的亲和性无关。GmPT1和GmPT2(?)勺生物信息学预测结果表明这两个蛋白的二级结构含有12个跨膜区域,在TM6和TM7间存在一个大亲水环。3.利用Tbpred预测服务器来预测GmPT1和GmPT2亚细胞定位,其预测结果为GmPT1和GmPT2是整合性膜蛋白。为了验证GmPT1和GmPT2亚细胞定位,将绿色荧光蛋白(GFP)融合到GmPT1或GmPT2的ORF的3’端。在以GmPT1/GFP或GmPT2/GFP进行转化的细胞可以观察到细胞周围有着清晰的荧光信号,转化空载的细胞则可以观察到整个细胞充满荧光信号。GmPT1/GFP和GmPT2/GFP融合蛋白定位在细胞的周边,表明这两个蛋白定位在细胞膜。这个结果与早期生化研究一致,这些数据表明GmPT1和GmPT2定位在细胞膜。4.利用抑制剂来验证Pi运输的pH依赖性。Pi运输活性在pH值4-7范围内进行研究,其活性在不同的pH值下表现出差异——当pH值为4时其活性达到最高并随着pH值升高其活性下降。为了研究质子驱动力对Pi运输活性的影响,本实验使用解偶联剂——2,4-二硝基苯酚(DNP)和羰基羟基氰氯苯腙(CCCP),这些解偶联剂可以破坏细胞膜内外的质子梯度。DNP在浓度为100gM时Pi吸收率相比较无抑制剂的对照减至79%(GmPT1)和82%(GmPT2)。CCCP在浓度为100μM时Pi吸收率相比较无抑制剂的对照减至77%(GmPT1)和80%(GmPT2)。钒酸盐——一种P-类型H+-ATPase(?)(?)制剂——在浓度为100μM时Pi吸收率相比较无抑制剂的对照减至82%(GmPT1)和83%(GmPT2)。这些结果表明其吸收率相比较对照明显地降低了。这些结果证实了GmPT1和GmPT2(?)(?)Pi/H+共转运依赖于细胞膜内外的pH梯度,其pH梯度的维持正是质膜上的H+-ATPase的作用。竞争实验表明不同的阳离子不会降低Pi吸收速率,表明GmPT1和GmPT2对Pi吸收的高度特异性。含有GmPT1和GmPT2的菌株在毫摩尔浓度(mM)的Pi浓度下其吸收率与含空载的菌株相似。在32Pi吸收实验中,其吸收过程中的前5min吸收速率是线性的,利用Lineweaver-Burk图可以计算GmPT1和GmPT2的Km,得到GmPT1和GmPT2的Km分别为6.65mM和6.63mM。因此,GmPT1和GmPT2是低亲和PT并且依赖于质膜内外的质子梯度。5.播种7d后的大豆幼苗的根系、茎和叶片组织用于研究GmPT1和GmPT2的表达。在低磷胁迫的48h之内,幼苗的根系、茎和叶片中GmPT1和GmPT2的表达量都是升高的。48h高磷处理后,将幼苗进行低磷胁迫,3h后其幼苗的根系、茎和叶片中GmPT1和GmPT2的表达量也是上调的。用Hoagland营养液浇灌的幼苗移栽到高磷溶液后,其幼苗的GmPT1和GmPT2的表达量只有轻微的改变。48h低磷处理的幼苗移栽到高磷溶液3h后,其根系、茎和叶片中的GmPT1和GmPT2的表达量降低。然而,GmPT1和GmPT2基因的表达水平并没有受到磷浓度影响而显著地改变(其相对倍数变化是很小的)并且这种变化趋势是复杂的,这表明GmPT1和GmPT2是轻微诱导表达。6.酵母单杂交结果说明GmPHR1与GmSPX1的启动子存在着互作,这表明GmPHR1是通过顺式元件来和GmSPX1互作,因此GmPHR1可能是大豆Pi信号途径中的关键性调节子。