论文部分内容阅读
随着社会老龄化的加重,骨质疏松等骨相关症状和疾病已经引起社会的广泛关注和重视,骨健康已经成为社会关注的一个焦点。同时,由于车祸等物理损伤以及骨肿瘤术后造成的骨缺损均需要人体进行合理的膳食来促进骨组织的再生和修复。黄芪已经作为食疗方剂的一部分进入到人们的生活中。其主要成分黄芪多糖,已被证明具有免疫调节、抗氧化、抗肿瘤、治疗糖尿病、抗病毒、保肝、抗炎和促进造血等生物学效应。本研究旨在通过体外细胞学替代法评价黄芪多糖对骨组织生长分化的生物学效应。第一部分,本研究选择了小鼠成骨细胞系MC-3T3-E1作为体外评价的细胞模型,通过24h细胞毒性实验,检测黄芪多糖对MC-3T3-E1细胞的半抑制浓度(IC50)为12.22mg/m L。通过细胞的IC50设置了实验浓度梯度为0.001、0.01、0.1和1mg/m L。通过CCK-8检测MC-3T3-E1细胞增殖发现黄芪多糖在0.001-0.1mg/m L浓度范围内随着浓度的升高表现出明显促进成骨细胞增殖的作用。而在ALP活性和钙沉积方面,黄芪多糖组表现出了促进细胞ALP活性和钙结节生成的作用。同时通过RT-PCR检测MC-3T3-E1细胞成骨相关基因的表达和激光免疫荧光共聚焦观察发现,黄芪多糖能够提高MC-3T3-E1细胞Runx2、OPN、OCN基因的表达水平和促进Col-I的分泌。总之,黄芪多糖表现出了一定的促进MC-3T3-E1成骨细胞增殖和分化的作用,进而说明黄芪多糖能够促进骨组织的再生。第二部分,本研究尝试建立以微载体为基础的三维立体培养评价方法。首先通过静电滴注装置和海藻酸钠分子辅助固型,制备了以明胶分子为主体的细胞微载体。通过对接收液Ca Cl2的浓度、明胶/海藻酸钠溶液浓度、电压、注射器针头与接收装置的距离以及注射器针头内径的探索,我们制备出球形规则,粒径大小均一的明胶/海藻酸微载体。用于后期评价的微载体制备条件为:Ca Cl2浓度为0.1M、明胶/海藻酸混合溶液浓度为12%、电压为10Kv、注射器针头与接收装置的距离为10cm、注射器针头内径0.6mm。第三部分,在制备出大量细胞微载体后,本研究建立了细胞/微载体三维立体培养方法,即将细胞接种于微载体表面进行三维立体培养,并评价了黄芪多糖在该培养条件下对MC-3T3-E1成骨细胞的生物学效应。发现在细胞增殖方面,该条件下黄芪多糖组的细胞增殖表现出,培养1d时没有明显的促进细胞增殖的作用,培养3d后表现出一定的促进细胞增殖的作用,但是在1mg/m L浓度时有所减弱。细胞在微载体表面生长良好,呈现成骨细胞的长梭形形态。通过p NPP检测ALP活性发现,黄芪多糖组在该培养条件下表现出了促进细胞ALP活性的作用。同时通过RT-PCR检测成骨相关基因的表达发现,黄芪多糖能够促进成骨细胞Runx2、OPN和OCN的表达水平。因此,黄芪多糖在细胞/微载体培养条件下表现出了一定的促进MC-3T3-E1成骨细胞增殖和分化的作用;同时由于该三维立体培养有利于细胞间的相互接触和保持稳定的微环境,该培养方法具备应用于体外替代动物实验进行生物学评价的潜力。第四部分,本研究建立了细胞@微载体三维立体培养方法,即将细胞包被于微载体的内部进行三维立体培养,并评价了黄芪多糖在该条件下对MC-3T3-E1成骨细胞的生物学效应。通过CCK-8检测细胞增殖发现,该条件下黄芪多糖组的细胞增殖表现出,在培养早期没有明显的促进增殖的作用,培养3d后表现出一定的促进细胞增殖的作用。在ALP活性方面,黄芪多糖组在该条件下表现出了促进细胞ALP活性的作用。同时通过成骨相关基因的表达检测发现,黄芪多糖能够促进成骨细胞Runx2、OPN和OCN的表达水平。同样说明了黄芪多糖对MC-3T3-E1成骨细胞增殖和分化的促进作用;同时由于该三维培养条件下,细胞在微载体内部更接近其在机体组织中的状态,该三维立体培养方法也具备应用于体外替代动物实验评价食品提取物生物学活性的潜力。第五部分,本研究通过MC-3T3-E1成骨细胞的增殖、ALP活性和不同阶段成骨相关基因表达的检测,比较了不同培养条件下黄芪多糖对MC-3T3-E1成骨细胞生物学效应的特点。发现在细胞增殖方面,二维平面培养在早期比较明显,而细胞/微载体三维立体培养条件下在7d时的细胞增殖优于二维平面培养,说明细胞/微载体三维立体培养方法适合中长期的生物效应评价。而细胞@微载体三维立体培养方法表现出了相对较弱的细胞增殖速率,但是亦能说明黄芪多糖对MC-3T3-E1细胞增殖的促进作用。在细胞成骨分化方面,两种动态培养条件下的细胞ALP活性和成骨相关基因的表达更为明显,尤其是细胞@微载体培养条件下,各实验组均表现出明显优于二维平面培养的ALP活性以及成骨相关基因的表达。说明三维培养条件下更利于评价黄芪多糖对成骨分化的作用。综上所述,三种培养方法均可用于体外评价黄芪多糖对MC-3T3-E1成骨细胞生物学效应的研究,二维平面培养在早期细胞增殖方面最明显,细胞/微载体三维立体培养适合中长期的评价,细胞@微载体三维立体培养在细胞分化方面表现最优。