噬菌体抗体库技术为人源性抗体的制备提供了良好的技术平台,并已成功研发大量人源性抗体用于科学研究、疾病诊断和临床治疗。噬菌体抗体库技术是在噬菌体表面表达Fab或scFv形式,将抗体蛋白融合表达在噬菌体外壳蛋白的N端,经过一个“吸附一洗脱一扩增”的富集过程,可以从抗体库中获得不同靶向性的特异性抗体,进而通过各种实验方法对抗体功能进行鉴定。本研究利用scFv噬菌体抗体库系统作为平台技术,分别对狂犬病毒和发热伴血小板减少综合征病毒进行人源基因工程抗体的筛选和功能鉴定,本研究主要分为两部分内容：一、鸡尾酒式人源抗狂犬病毒基因工程抗体的研究狂犬病是由狂犬病毒(Rabies Virus,RV)引起的人兽共患疾病,发病后死亡率几乎达百分之百。狂犬病毒属弹状病毒科狂犬病毒属,基因组编码五种结构蛋白,其中由G基因编码的糖蛋白,是病毒与宿主细胞结合的配体,能诱导机体产生中和抗体,主要具有Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ号中和性抗原位点。根据世界卫生组织推荐,对狂犬病Ⅲ级暴露后的预防主要是采用狂犬疫苗注射结合抗狂犬病毒免疫球蛋白的方法。由于目前使用的两类RIG为人抗狂犬病毒免疫球蛋白和马抗狂犬病毒免疫球蛋白存在缺陷,由于狂犬病毒糖蛋白的序列并不十分保守,使用针对单一中和抗原位点的单克隆抗体不能起到广谱安全的疗效,因此,研制具有广谱抗狂犬病毒中和活性的单克隆抗体,并将针对不同表位的中和抗体联合组成鸡尾酒式配伍制剂就显得尤为重要。本研究scFv噬菌体表面展示技术为平台,从狂犬疫苗免疫者中获得抗体基因,用特异性PCR引物扩增抗体重链和轻链可变区基因,构建人源抗狂犬病毒噬菌体抗体库,经过高效噬菌体包装,通过亲和筛选获得5株抗狂犬病毒scFv抗体(RV1C3、RV2G12、RV1C5、RV1A11、RV2F5)。scFv抗体通过VH/VK双质粒系统真核进行IgG抗体表达,纯化后利用SDS-PAGE、ELISA、IFA、Western Blot和亲和力测定等实验方法对获得的IgG抗体进行功能鉴定,结果表明5株人源IgG抗体均特异性结合狂犬病毒糖蛋白,亲和力达到10-9M以上。利用快速免疫荧光灶抑制中和试验对单抗的中和活性进行检测,结果表明5株单抗对狂犬病毒aG株具有中和活性,但对狂犬病毒CVS株缺乏中和活性。通过竞争ELISA结合糖蛋白中和表位的关键位点突变对抗体结合表位进行鉴定,结果表明我们获得的5株抗体识别的Ⅱ号抗原表位。为获得针对狂犬病毒糖蛋白Ⅲ号表位的特异性抗体,我们采用scFv噬菌体展示平台,对一株糖蛋白Ⅲ号表位中和抗体CR4098采用链置换法进行改造,通过轻链置换,我们获得14株抗狂犬病毒scFv抗体,经真核表达IgG抗体,通过ELISA,IFA、亲和力测定及中和试验验定人源抗体RV3A5特异性结合狂犬病毒糖蛋白,亲和力达到2.8×10-gM,对狂犬病毒aG株和CVS株均具有良好的中和活性。通过竞争ELISA结合糖蛋白中和表位的关键位点突变对抗体结合表位进行鉴定,结果表明RV3A5特异性识别的糖蛋白Ⅲ号抗原表位。我们分别选取分别针对狂犬病毒糖蛋白Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ号抗原表位的三株单克隆抗体对CR57、RV08和RV3A5进行狂犬病毒多种毒株的交叉中和试验,显示三种抗体鸡尾酒式配伍对不同毒株均具有较好的中和活性。对CR57、RV08和RV3A5进行狂犬病毒暴露后动物保护活性测定,用狂犬病毒CVS-11株对仓鼠攻毒,单独或三株抗体配伍进行免疫保护,结果发现三株人源单克隆抗体及鸡尾酒配伍均产生良好的动物保护活性。综上所述,本部分研究运用噬菌体抗体库技术,成功构建人源抗狂犬病毒scFv噬菌体抗体库,通过高通量筛选获得具有高亲和力的特异性针对狂犬病毒糖蛋白的人源抗体,良好的中和活性及动物保护活性,为鸡尾酒式单克隆抗体配伍制剂取代RIG做为狂犬病暴露后预防的被动免疫制剂奠定了基础。二、人源抗发热伴血小板减少综合征病毒核蛋白抗体及表位研究发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒(Seve fever with thrombocytopenia syndrome bunyavirus, SFTSV)属于布尼亚病毒科白蛉病毒属,作为一种新发病毒,人们对SFTSV感染过程及其在体内引发的体液免疫了解甚少,本研究采用噬菌体抗体库系统筛选人源抗SFTSV单克隆抗体,探讨机体对SFTSV感染引发体液免疫反应的机制。首先我们从山东省2位发热伴血小板综合征恢复期病人外周血中分离淋巴细胞,提取细胞总RNA,逆转录cDNA,利用人特异性IgGl引物扩增抗体轻链和重链Fd段基因片段,分别克隆入pComb 3H载体,构建成人源抗SFTSV的Fab噬菌体抗体库。为筛选到目的蛋白的特异性抗体,我们分别采用纯化的SFTSVHB29株病毒颗粒及重组核衣壳蛋白NP对Fab噬菌体抗体库进行富集筛选,经过三轮“吸附-洗脱-富集”过程,随机挑选1200个Fab克隆进行原核表达,通过ELISA和IFA方法进行检测,结果共获得94株序列不同的特异性针对SFTSV核蛋白的人源Fab单克隆抗体,未获得针对病毒糖蛋白的特异性抗体。另外,通过传统杂交瘤技术制备针对SFTSV病毒颗粒的鼠源单克隆抗体,在随机挑选的1000个克隆中,462个克隆针对核蛋白,16株针对糖蛋白。在人源和鼠源单克隆抗体的基础上,通过竞争ELISA、分子模拟和定点突变对SFTSV核蛋白进行表位研究,竞争ELSIA结果表明SFTSV核蛋白至少存在4个不同的抗原表位,基于分子对接预测的定点突变实验表明核蛋白N端第10位谷氨酸突变为丙氨酸时,大部分人源单克隆抗体对核蛋白的结合活性明显降低甚至消失。综上所述,本部分研究成功从SFTS病人中分离到大量针对核蛋白的单克隆抗体,表明核蛋白具有强免疫原性,在SFTSV感染引发的机体体液免疫中发挥重要作用,并通过表位分析发现氨基端是核蛋白最主要的抗原表位,为SFTSV感染的诊断和研究提供了分子基础。