子宫内膜异位症(endometriosis.EM)是妇科常见的良性疾病之一,在生育期妇女中发病率为10-15%,因其临床表现多变,仅依据其临床表现往往不能确诊,故EM的实际发病率甚至更高。EM以痛经、不孕、性交痛等临床症状为特征,严重影响了患病妇女的生活质量。EM的病因目前尚不清楚。目前多数学者认可Sampson的种植学说。根据此学说,异位病灶在形成和生长过程中需要氧和营养物质供应。研究表明,新生血管生成是EM的重要特征。而目前对EM新生血管生成的机理了解尚不透彻。EM治疗目前以手术和药物治疗为主,手术有较高的复发率,而药物治疗存在药物副作用及停药症状复现等问题。由于EM对血管生成高度依赖,近年来EM抗血管生成治疗开始得到关注。在抗血管生成治疗的研究中,以VEGF-A为靶点的药物研究得最多,但发现药物远期疗效不佳,提示血管生成可能通过其他途径发生了代偿。近年来研究表明,多种肿瘤细胞表达一种大分子蛋白S LIT2.体外实验证实这种大分子蛋白能通过与脐静脉内皮细胞上的ROBO1受体结合从而诱导脐静脉内皮细胞定向运动,动物体内实验证明该分子SL工T2能促进肿瘤新生血管生成。由于子宫内膜异位症在生物学行为上类似恶性肿瘤,且对血管生成高度依赖,故S LIT2极有可能也在异位内膜病灶表达。SLIT2的表达同时也可以解释抗血管生成治疗研究中的耐药问题,即在VEGF-A等已知途径外尚存在其他血管生成机制,当阻断VEGF-A后,极有可能通过其他血管生成途径发生了代偿,从而药物疗效不佳。前期研究用免疫组织化学的方法已证明S LIT在异位内膜中表达,与正常内膜中的表达相比上调,且其表达与微血管密度(MVD)密切相关。由于该免疫组化实验中用到的抗体同时结合三种S LIT亚型,故哪一种或几种亚型在异位灶中表达尚不清楚。由于间质细胞在异位病灶的黏附、生长等过程中发挥了关键作用,故本研究拟从细胞水平研究异位内膜间质细胞中SLIT2及其受体ROB01的表达,并探讨可能的调控因素及调控机理。第一部分：SLIT2在人异位内膜间质细胞中的表达目的：检测原代培养的异位内膜间质细胞中是否存在SLIT2 mRNA表达；若有表达,相对于正常妇女子宫内膜来源的间质细胞中SLIT2 mRNA的表达水平有无区别；探讨SLIT2 mRNA表达在月经周期中是否波动。方法：用原代培养的方法获得异位内膜间质细胞和正常内膜间质细胞；用RT-PCR方法检测其中有无SLIT2 mRNA的表达；用相对定量Real-time PCR方法观察SLIT2 mRNA表达在月经周期中是否波动；用相对定量Real-time PCR方法比较SLIT2 mRNA在异位内膜间质细胞和正常内膜间质细胞中表达的高低。结果：在异位内膜间质细胞和正常内膜间质细胞中存在SLIT2、SLIT3、ROBO1、ROBO2 mRNA的表达,四者密切相关；SLIT2 mRNA水平在异位内膜间质细胞中表达较高。SLIT2 mRNA表达在月经周期中存在波动。结论：SLIT2 mRNA在异位内膜间质细胞中高表达。第二部分：调控异位内膜间质细胞中SLIT2表达的因素目的：探讨异位内膜间质细胞中SLIT2表达的调控因素。方法：用相对定量Real-time PCR方法检测不同浓度或作用时间时雌激素、孕激素或TNF-α对SLIT2 mRNA表达的影响；用Western blot方法检测10-7mol/L雌激素、0.1ng/mlTNF-α对SLIT2蛋白表达的影响。结果：SLIT2表达受雌激素与TNF-α调控,雌激素与TNF-α调控SLIT2 mRNA表现出浓度依赖性,10-7mol/L 17β雌二醇与0.1ng/ml TNF-α显著上调SLIT2 mRNA及蛋白水平。孕激素对SLIT2 mRNA调控不明显。结论：雌激素与TNF-α可调控异位内膜间质细胞中SLIT2 mRNA和蛋白表达。第三部分：雌激素调控SLIT2表达的机理目的：探讨异位内膜间质细胞中雌激素调控SLIT2表达的机理。方法：以雌激素受体拮抗剂ICI 182780.P13K/Akt信号转导通路抑制剂Aktinhibi tor IV和LY294002.eNOs抑制剂L-NAME分别作用于异位内膜间质细胞,用Western blot方法观察其是否抵消雌激素诱导的SLIT2蛋白表达,以检测雌激素上调SLIT2是否通过雌激素受体ER.PI3K/Akt信号通路及其下游的eNOs信号通路介导；分别以ERα和ERβ特异性激动剂PPT和DNP作用于异位内膜间质细胞,用Western blot方法观察SLIT2表达是否上调,以检测介导雌激素上调SLIT2的ER受体亚型；以Akt过表达质粒转染异位内膜间质细胞,用Western blot方法观察SLIT2表达是否上调,以检测Akt是否介导SLIT2表达。结果：1μM IC1182780.100nM Akt inhibitorIV.10 u M LY294002.500μM L-NAME均明显下调异位内膜间质细胞中本底的SLIT2.ROBO表达及10-7mol/L17β-雌二醇诱导的SLIT2.ROBO1表达。ERα激动剂PPT和ERβ激动剂DPN均上调SLIT2表达,且均能被ICI 182780所抑制。将异位内膜间质细胞转染Akt过表达质粒后,总Akt、磷酸化Akt及SLIT2.ROBO1水平均明显上调.结论：雌激素上调异位内膜间质细胞中SLIT2蛋白表达通过雌激素受体ERα和ERβ介导；雌激素上调异位内膜间质细胞中SLIT2蛋白表达通过PI3K-Akt-eNOs信号通路介导。