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肿瘤坏死因子α(TNF-α)可介导多种细胞的凋亡或增殖，在体内、外均有抗肿瘤活性，对多种肿瘤的治疗有效。美欧各国前列腺癌发病率占男性癌症的第1～2位，近年来我国前列腺癌发病也呈现增长趋势。前列腺癌患者常采用根治性前列腺切除术及内分泌疗法完全阻断其雄激素的主要来源进行治疗，但前列腺癌细胞仍可利用肾上腺合成的雄激素前体物质合成睾酮。实验表明，微量雄激素对前列腺癌细胞增殖的影响最明显。微量雄激素的存在是否影响TNF-α的抗前列腺癌细胞增殖作用，尚未见报道。本研究拟通过体外培养的雄激素敏感前列腺癌LNCaP细胞和非雄激素敏感前列腺癌DU-145细胞，采用MTT法观察DHT和TNF-α对两种细胞增殖的影响，在此基础上观察微量DHT对TNF-α抑制前列腺癌细胞增殖作用的影响，并采用免疫组化法和ELISA法探讨雄激素受体与白细胞介素-6是否参与微量DHT对TNF-α抑制前列腺癌细胞增殖的影响。旨在为临床应用TNF-α治疗前列腺癌提供理论依据。 为了解体内存在的微量雄激素对前列腺癌细胞增殖的影响，首先观察了100，10，1，0.1nmol／L的DHT对LNCaP和DU-145细胞增殖的影响。结果表明，与对照组(0mol／LDHT)比较，100～0.1nmol／L的DHT明显刺激LNCaP细胞增殖(较对照组增加42.4％～103.6％)，随着DHT浓度的增加刺激增殖作用逐渐减弱。100～0.1nmol／L的DHT对DU-145细胞的增殖无明显影响。雄激素通过AR发挥作用，免疫组化实验表明LNCaP细胞AR染色阳性，DU-145细胞AR染色阴性，可见AR表达与否是DHT对两种细胞增殖作用呈现明显差异的主要原因。 实验观察了TNF-α对LNCaP和DU-145细胞增殖的影响。结果表明，与对照组(0U／miTNF-α)比较，4000、1000、250，62.5和15.6U／ml的TNF-α均能明显抑制LNCaP细胞增殖，随着TNF-α浓度的增高抑制作用逐渐增强；同一浓度范围的TNF-α对DU-145细胞增殖的抑制作用虽然也有统计学差异，也呈现剂量依赖效应，但抑制作用明显较小，因而临床意义不明显。同一浓度的TNF-α对LNCaP和DU-145细胞增殖的抑制作用有明显差异(P＜0.01)。这一结果证实前列腺癌细胞对TNF-α的敏感性与其雄激素敏感性一致。 在此基础上，观察了微量DHT(终浓度1nmol／L)是否影响TNF-α(终浓度1000U／m1)抑制前列腺癌细胞增殖的作用。结果表明，DHT消除了TNF-α对 颀士研究生学位论文 中义摘要 LNCaP细胞增殖的抑制作用，但不影响hF－a对DU－145细胞增殖的作用。这 一结果提示：临床使用hF－口治疗雄激素敏感前列腺癌时，应使用抗雄激素药 物完全阻断雄激素，包括肾上腺来源雄激素的作用，以防微量雄激素消除TNF－ a的抗瘤作用。 许多证据表明 IL七与前列腺癌有关。免疫组化检测发现 LNCaP和 DUJ 细胞均表达IL－6。由此推测IL－6可能参与了TNF－a和／或DHT对前列腺癌细 胞增殖的作用。免疫组化检测表明，TNF－a和／或 DHT对 LNCaP和 DUJ 细 胞的 AR表达和IL七表达均无明显影响。实验采用双抗体夹心 ELISA法检测（检 测灵敏度为 10Pg／mlX 未能在 LNCaP细胞条件培养液中检测出 IL巧，提示 LNCaP细胞不分泌或只分泌少量！L6，TNF a和／或DHT对LNCaP细胞分泌 IL6无明显影响。DHT不影响 DU－145细胞分泌 IL－6，但 TNF－a和 TNFa＋DHT 明显增加DU－145细胞条件培养液中IL－6含量，两组间无明显差异，表明y F－ a促进DU－145细胞分泌IL－6，TNF a与DHT在促进DU－］45细胞分泌IL－6 方面无协同作用。 采用抗IL6抗体封闭IL．6作用后，进一步观察了TNF－a和／或DHT对前 列腺癌细胞增殖的影响。结果表明，IL6 不影响TNF－a和／或DHT对LNCaP 和 DU－145细胞的增殖作用，提示 IL－6未参与 hF。以和／或 DHT对两种前列腺 癌细胞增殖的影响。DHT消除TNF－a抑制前列腺癌细胞增殖的作用与IL－6无 关、但几－6Ah明显抑制LNCaP和DU－145细胞增殖，表明几－6是前列腺癌细 胞的生长因子，提示抑制IL－6的生成和分泌是治疗前列腺癌的有效辅助方法。 Western blot实验结果表明，外源性IL－6上调 LNCaP细胞的AR表达，增强 LNCaP细胞对雄激素的敏感性，进而促进LNCaP细胞增殖。 免疫组化检测结果表明，TNF－a和／或 DHT对 LNCaP和 DUl 细胞的 AR表达无明显影响，提示 AR未介导 hF－a和／或 DHT对 LNCaP和 DUJ 细胞增殖的影响，AR与微量DHT消除TNF－a抑制LNCaP细胞的增殖无关。 综上所述，前列腺癌细胞对TNF－o的敏感性与其雄激素敏感性一致。在无 DHT存在时，hF－口抑制雄激素敏感LNCaP细胞增殖；但有微量DHT存在 时，TNF－口抑制前列腺癌细胞增殖作用消失，IL－6和AR未参与这一作用。IL－6 可通过上调LNCaP细胞AR的表达，加强DHT的作用，进而刺激LNCaP细胞 增殖。由此可见，本实验对尚处于雄激素敏感的前列腺癌?