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目的：建立测定人类Gfi1mRNA表达量的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法,为进一步研究新基因的功能奠定基础。方法：以Gfi1基因为靶基因设计引物。构建携带Gfi1cDNA的质粒pLOX-Gfi1,经过纯化,质粒浓度测定,拷贝数的计算及10倍的梯度稀释制备标准品。应用ABI steponePCR仪对Gfi1进行实时荧光定量PCR检测,建立标准曲线和熔解曲线。结果：建立了Gfi1mRNA表达的实时荧光定量PCR方法,本法线性范围为6.36x102-6.36×108copies/μl,线性相关系数γ2为0.996,熔解曲线为单峰,Tm值为(89.98±0.22)℃,标准品的循环阈值批内变异系数和批间变异系数分别为1.35%-3.61%和1.49%-3.42%。结论：本研究建立的Gfi1mRNA表达实时荧光定量PCR检测方法速度快,灵敏度高,特异性强,重复性及稳定性好,可用于Gfi1基因的定量检测。目的：研究Gfil在慢性粒细胞白血病患者中的表达情况,了解慢性粒细胞白血病经骨髓移植或格列卫治疗后Gfi1表达的变化,以及Gfi1与BCR/ABL表达的关系,探讨Gfi1在CML发生和发展中的作用。方法：1.实时荧光定量PCR法检测99例慢性粒细胞白血病患者单个核细胞中Gfi1 mRNA的表达情况,包括CML-CP62例,CML-AP/BC9例,有21例CML-CP的患者进行骨髓移植,7例给予格列卫治疗,11例正常健康供者作对照；2.流式细胞仪分选骨髓单个核细胞中CD34+细胞,包括6例CML,9例正常对照,采用实时荧光定量PCR法及western-blot法检测Gfi1 mRNA及蛋白的表达；3.实时荧光定量PCR法检测CML患者骨髓单个核细胞BCR/ABL融合基因的表达情况；4.采用Prism3软件对数据进行统计学处理。结果：1.CML患者慢性期骨髓单个核细胞Gfi1 mRNA的表达为2.042,而正常对照为0.342,其表达明显增高p=0.005；尽管加速期和急变期Gfi1的表达也有所增加,但是增加的程度与疾病的进展没有很大的关系,CML-AP/BC:正常的P值为0.012,CML-CP:CML-AP/BC的P值为0.189；2.对21例进行异基因造血干细胞移植的患者移植前Gfi1 mRNA的表达为2.242,移植后为0.368,P<0.0001；7例格列卫治疗前Gfi1 mRNA的表达为2.891,治疗后为0.208下降约10倍,P=0.014；3.CML患者骨髓单个核CD34+的细胞中Gfi1 mRNA的表达比正常对照显著升高p=0.026；4.BCR/ABL融合基因与Gfi1 mRNA的表达水平具有显著的相关性(r2=0.65,p<0.0001)；5.通过流式细胞分析,我们发现CML患者慢性期骨髓单个核细胞及CD34+细胞Gfi1的蛋白表达水平比正常对照组明显升高；6.western blot检测显示CML患者慢性期CD34+细胞Gfi1的蛋白表达水平比正常对照明显升高。结论：慢性粒细胞白血病患者Gfi1mRNA和蛋白水平的表达明显上调,治疗后Gfi1转录本会明显下降,并且与BCR/ABL的表达具有显著的相关性。Gfi1可能是慢性粒细胞白血病的致病因子,慢性粒细胞白血病患者BCR/ABL融合基因形成导致ABL酪氨酸蛋白激酶活化可能引起Gfi1表达的改变。目的：研究慢病毒介导人Gfi1在32D细胞的表达,建立稳定高表达Gfi1的32D细胞株,观察其对32D细胞增殖的影响。方法：制备完整的重组慢病毒载体三质粒系统：转移质粒(pLOX-Gfi1/pLOX),包装质粒(pCMVAR8.2)及包膜蛋白质粒(pMD.G),共转染293T细胞,获得慢病毒颗粒,病毒滴度测定,并转染32D细胞,无菌流式分选获取稳定高表达Gfi1的32D细胞,采用细胞计数法,集落形成实验检测Gfi1对32D细胞增殖的影响。结果：(1)慢病毒的三种质粒可以高效转染293T细胞,并成功包装出高滴度慢病毒,病毒滴度在3.5×105TU/ml-4.3×105TU/ml之间,可满足后续实验需要；(2)Western-blot能检测到Gfi1蛋白在及32D细胞中的表达,获得稳定表达Gfi1的32D细胞克隆；(3)低浓度IL-3细胞增殖实验显示32D/Gfi1的增殖能力增强；(4)IL-3撤退实验显示32D/Gfi1的存活能力增强；(5)软琼脂集落形成实验显示32D/Gfi1克隆形成能力增强。结论：慢病毒介导的Gfi1基因可以高效稳定转染32D细胞,并持续表达,可以作为研究Gfi1基因功能的重要技术手段；Gfi1对32D细胞的增殖有重要影响。