脱氧尿苷焦磷酸酶(dUTPase)是DNA合成中一种重要水解酶,它能水解脱氧尿苷三磷酸(dUTP)形成脱氧尿苷单磷酸(dUMP)和无机焦磷酸PPi,防止DNA复制过程中dUTP浓度过高而引起错误掺入,从而降低细胞中dUTP/dTTP的比例,保证DNA复制的正确性和顺利进行。dUTPase作为细胞内dUTP水平的主要调节者,已经被用作许多抗癌和抗病毒感染性疾病药物的作用靶子,临床上也已经有了用胸苷酸合成酶抑制剂和二氢叶酸还原酶拮抗剂进行治疗。本文以腾冲热海栖热菌噬菌体TSP4为材料,对高温噬菌体脱氧尿苷焦磷酸酶进行了相关研究。将编码TSP4dUTP焦磷酸酶的TSPdUTPase基因通过PCR扩增、连接、转化后得到重组表达菌pET-32a-TSPdUTPase/Rosetta(DE3),重组蛋白pET-32a-TSPdUTPase在16℃、终浓度为1mM IPTG诱导8小时的条件下能大量的表达。使用Ni-NTA agarose亲和层析柱纯化表达的TSPdUTPase,并对其活性,最适作用温度、pH、底物特异性以及金属离子对其活性的影响进行分析。结果表明,它的最适催化温度和pH分别为65℃和7.5,最佳催化底物为dUTP, Mg2+对dUTPase的活性非常重要,而且如果没有Mg2+的参与,脱氧尿苷焦磷酸酶dUTPase则不能显示其活性。同时发现EDTA能够抑制脱氧尿苷焦磷酸酶dUTPase的活性,它能够与Mg2+竞争的和脱氧尿苷焦磷酸酶dUTPase相结合,从而使其酶活降低。为了检测重组蛋白TSPdUTPase在不同温度下热稳定性和酶活变化,本文采用ANS荧光探针法检测其在不同温度下结构的变化,结果表明TSPdUTPase在65℃以下比较稳定,在75℃下处理半小时酶活会下降到一半左右,在80℃下会没有酶活。为了探索分子伴侣TSPcpn47对重组蛋白TSPdUTPase热稳定性的影响,本文将同样从噬菌体TSP4基因组中克隆表达出的分子伴侣TSPcpn47与TSPdUTPase进行相互作用,结果发现,在两者共存的条件下,dUTP焦磷酸酶的热稳定性有了很大的提升,证明了分子伴侣TSPcpn47能提高蛋白质热稳定性,这表明分子伴侣可能与嗜热菌能够生存在极端高温的环境相关。本实验对进一步深入研究高温噬菌体的耐热抗逆的分子机制奠定了良好的基础。