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第一部分趋化因子及其受体在阴道念珠菌病小鼠模型中的表达及其意义【目的】检测阴道念珠菌病小鼠模型中趋化因子及其受体的表达,探讨趋化因子及其受体在小鼠阴道念珠菌病发病中的作用。【方法】将试验小鼠随机分为A组(雌激素处理感染组)、B组(雌激素处理未感染组)、C组(未用雌激素处理感染组)及正常组,前3组又分为2d、4d、7d、14d及21d组,每组各5只。建立阴道念珠菌病小鼠模型,从微生物学及组织病理学角度对小鼠的感染状态进行评估,继之以RT-PCR、Real-time RT-PCR、免疫组织化学染色SABC法及ELISA方法检测接种白念珠菌后各时间点小鼠阴道粘膜及腰淋巴结中趋化因子及其受体的表达。【结果】(1)阴道真菌载量:A组小鼠阴道内为持续感染,其真菌载量持续维持在高水平,菌丝评分与感染的严重程度有关;B组小鼠整个21d观察不到任何真菌菌落;C组小鼠早期(2~7d)真菌载量较A组低(P<0.05),第14d真菌载量迅速下降,第21d基本观察不到真菌菌落。(2)阴道粘膜病理学改变:A组小鼠白念珠菌接种后第2d,阴道腔内即可见少量紫红色线状菌丝,有PMNs浸润;第4d阴道腔内可见成团紫红色线状菌丝及卵圆形孢子,同时见大量PMNs;第7d不仅阴道腔内可见成团菌丝及孢子,亦可见菌丝及孢子由粘膜表面向角质上皮穿透,阴道腔内、阴道粘膜及粘膜下可见大量的以PMNs为主的炎性细胞浸润;第14d阴道腔内可见部分菌丝断裂;第21d阴道腔内断裂菌丝较前增多。C组小鼠接种后第2~7d病理改变基本同A组,第14d时阴道腔内仅见少量菌丝,21d时未见明显菌丝及孢子。B组小鼠阴道腔及阴道粘膜未见菌丝及孢子。(3)雌激素对阴道粘膜及淋巴结趋化因子及其受体的mRNA表达无明显影响。所有感染组小鼠的阴道粘膜趋化因子及其受体的mRNA水平均明显升高(P<0.05),其中A组小鼠阴道趋化因子水平持续维持在较高水平,C组小鼠在感染消退时(第14d和21d时)其阴道趋化因子的产生亦降至基础水平;而相应的趋化因子受体在A组和C组小鼠阴道粘膜均见明显升高(P<0.05)。与之不同的是,在腰引流淋巴结,感染组小鼠MCP-1、MCP-2、IP-10及MIG均未见明显改变(P>0.05),SDF-1则在A组小鼠感染后第2d, 7~21d明显升高(P<0.05),C组无明显变化(P>0.05)。趋化因子受体CCR2在A组小鼠感染后第7~21d明显升高(P<0.05),C组无明显变化(P>0.05);CXCR3分别在A、C组小鼠感染后第7d、第4~14d明显升高;CXCR4分别在A、C组小鼠感染后第2~21d, 7~14d明显升高(P<0.05)。(4)对A组小鼠阴道粘膜MCP-1、CCR2及IP-10 mRNA水平进一步行Real-time RT-PCR定量分析:MCP-1 mRNA在感染后各时间点均明显升高(P<0.05),第14d达高峰(升高9.254倍);CCR2在感染后第7~21d明显升高(P<0.05),第7d达高峰(升高5.278倍);IP-10在感染后第7~21d明显升高(P<0.05),第14d达高峰(升高7.013倍)。以MCP-1升高最为明显。(5)免疫组化结果显示A组小鼠阴道粘膜中趋化因子MCP-1、SDF-1及CXCR4主要在角质形成细胞上表达,MCP-1位于胞核及胞浆,SDF-1及CXCR4则主要位于胞浆及胞膜。此外,固有层中浸润的部分炎性细胞及血管内皮细胞的胞浆亦可见MCP-1、SDF-1及CXCR4表达。B组及正常组小鼠阴道粘膜未见MCP-1、SDF-1及CXCR4的表达。半定量分析结果表明:A组小鼠在接种白念珠菌后各时间点MCP-1、SDF-1及CXCR4表达均明显增加(P<0.05)。其中MCP-1在接种后第2d即见表达,2周时达高峰并持续到第3周。SDF-1及CXCR4的表达在接种后第2d即开始增加,第7d时达高峰,第14d和21d开始下降。(6)对小鼠阴道粘膜及淋巴结MCP-1蛋白水平行ELISA检测,可见MCP-1在A组小鼠感染后各时间点均明显升高,C组小鼠感染后第7d明显升高(P<0.05);而腰淋巴结MCP-1在感染前后无明显改变(P>0.05)。(7)阴道灌洗液涂片后染色显示,PMNs、巨噬细胞、淋巴细胞和其他类型白细胞所占比例在白念珠菌感染或雌激素造成的假发情状态下无明显改变(P>0.05)。【结论】趋化因子及其受体可能在局部阴道黏膜白念珠菌感染中起一定的作用。此外,SDF-1及趋化因子受体亦可能参与淋巴结对白念珠菌的防御。第二部分白念珠菌与树突状细胞的相互作用及其机理【目的】研究白念珠菌与树突状细胞(dendritic cell, DC)相互作用后,白念珠菌对DC吞噬功能、表面标志及其电生理学特性的影响,体外水平探讨DC在机体抵御白念珠菌感染中可能的作用。【方法】(1)将白念珠菌加入DC2.4细胞培养基中,动态观察二者共孵育后30min, 1h及2h后DC2.4的吞噬功能。(2)应用流式细胞计量术检测与白念珠菌共孵育前、孵育后2h及4h时DC2.4表面MHCⅡ及共刺激分子CD80、CD86的表达。(3)应用膜片钳全细胞记录模式观察白念珠菌对DC Ik(delayed rectifier potassium current,延迟整流钾电流)的影响及伊曲康唑注射液(斯皮仁诺)对白念珠菌致DC Ik电流增加的影响。(4)应用激光扫描共聚焦显微镜观察白念珠菌对DC2.4细胞内钙浓度(intracellular calcium concentration, [Ca2+]i)的影响及伊曲康唑、氟康唑注射液(大扶康)分别对静息状态下DC[Ca2+]i及白念珠菌致DC[Ca2+]i升高的影响。【结果】(1) DC2.4与白念珠菌共孵育30min, 1h及2h后,吞噬百分率分别为74.76±1.04%, 76.42±1.13%及90.99±1.42%;吞噬指数分别为1.328±0.023, 2.386±0.041, 3.844±0.037。(2)与孵育前相比,孵育后2h DC2.4细胞上CD80分子的表达显著上升,细胞阳性比率由孵育前41.22%升至73.91%,平均荧光强度也由61.34升至81.94(P<0.05);孵育后4h CD80分子的表达有所下降,细胞阳性比率50.85%,平均荧光强度57.52;但较孵育前仍升高(P<0.05)。CD86在孵育前已高表达,细胞阳性比率98.92%,故孵育后表达变化不明显,2h和4h分别为96.93%和93.57%(P>0.05)。MHCⅡ在孵育前仅1.13%,荧光强度48.36;孵育后2h升至3.79%,荧光强度56.1(3P<0.05);4h降为0.64%,荧光强度43.17,较孵育前无明显改变(P>0.05)。(3)白念珠菌使DC2.4细胞Ik峰值可逆性升高(30.03±5.76)%,用标准细胞外液洗脱白念珠菌后Ik电流可部分恢复。伊曲康唑本身对DC2.4细胞Ik峰值无明显影响(P>0.05),其与DC2.4预孵育10min后可使白念珠菌致DC Ik电流增加的幅度减小(P<0.05)。此外,白念珠菌可使DC2.4 Ik的I-V曲线升高。(4)白念珠菌使DC2.4细胞[Ca2+]i荧光强度增加,且呈浓度依赖性。伊曲康唑本身即可使DC2.4细胞[Ca2+]i荧光强度降低,与DC2.4预孵育后可使白念珠菌致DC [Ca2+]i升高的幅度减小(P<0.05)。氟康唑对DC[Ca2+]i及白念珠菌致DC[Ca2+]i的升高无明显影响(P>0.05)。【结论】(1)白念珠菌可能通过升高DC Ik电流及[Ca2+]i而促进其表面CD80及MHCⅡ表达升高,吞噬功能增强,进而影响DC的免疫功能状态。(2)抗真菌药物伊曲康唑可能通过降低DC [Ca2+]i及白念珠菌致DC Ik电流及[Ca2+]i升高的幅度进而抑制DC的功能,对宿主的免疫系统起负性调节作用;而氟康唑对DC的功能可能无明显影响。