【摘 要】
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目的:构建OY-TES-1氨基端截短蛋白（OY-TES-1-N）重组质粒、体外表达OY-TES-1-N蛋白,对表达产物进行纯化和鉴定,为OY-TES-1后续研究奠定基础。方法:（1）提取人睾丸组织总RNA,逆转合
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目的:构建OY-TES-1氨基端截短蛋白（OY-TES-1-N）重组质粒、体外表达OY-TES-1-N蛋白,对表达产物进行纯化和鉴定,为OY-TES-1后续研究奠定基础。方法:（1）提取人睾丸组织总RNA,逆转合成cDNA;（2）扩增OY-TES-1氨基末端268（A6-R273）个氨基酸（AA）的cDNA序列;（3）将PCR扩增产物插入原核表达载体pMAL-C2,构建pMAL-C2-OY-TES-1-N重组质粒并转化DH5a菌;（4）通过蓝白斑筛选、DNA测序筛出正确的pMAL-C2-OY-TES-1-N重组质粒,再将其转化TB1菌进行表达;（5）用IPTG对重组菌进行诱导表达,并对IPTG浓度和加入时机以及诱导温度和诱导时间进行优化;（6）通过SDS-PAGE电泳鉴定表达的MBP-OY-TES-1-N融合蛋白;（7）融合蛋白通过Amylose-resin亲和层析柱纯化,将纯化的MBP-OY-TES-1-N蛋白进行Western Blot初步鉴定及蛋白质串联质谱分析鉴定。结果:重组质粒pMAL-C2-OY-TES-1-N测序与已知序列相同;成功诱导表达出融合蛋白MBP-OY-TES-1-N。确定了pMAL-C2.OY-TES-1-N体外表达的优化条件:37℃振荡培养3小时,加入IPTG（终浓度为0.3mmol/L）,然后在32℃振荡培养4小时;蛋白质飞行质谱仪分析所得的肽段与目的蛋白相符。结论:成功构建了pMAL-C2-OY-TES-1-N重组质粒,并高效表达了MBP-OY-TES-1-N融合蛋白。为后续OY-TES-1基因的研究打下基础。
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