去甲基四环素（Demecycline,DMTC）和去甲基金霉素（demeclocycline,DMCTC）分别是四环素和金霉素缺失了C6位甲基的衍生物。它们是合成四环素类药物米诺环素和替加环素的重要前体。目前去甲基四环素和去甲基金霉素主要通过生物发酵方式获得,而已有的生物合成菌株是通过对金黄色链霉菌进行随机突变得到的。这些菌株的遗传背景并不清楚,限制了以提高生物合成效能为目的的代谢工程改造。通过前期对金霉素生物合成的研究,已经从金霉素高产菌株金黄色链霉菌F3中成功克隆得到了完整的金霉素生物合成基因簇,并推测了金霉素的生物合成途径。其中,该基因簇中编码的Ctc K经过预测为C-甲基转移酶,可能负责催化中间体pretetramid向6-methylpretetramid的转化。因此,基于Ctc K功能研究的代谢工程改造可能有助于去甲基四环素和去甲基金霉素高效生物合成菌株的构建,以期为实际工业生产利用提供优良菌株。首先,对Ctc K进行生物信息学分析。对该蛋白进行NCBI Blastp比对分析,发现它可能是S-腺苷甲硫氨酸（SAM）依赖的C-甲基转移酶,与土霉素生物合成途径中的Oxy F、配位诺卡菌素生物合成途径中的Chd MI和大器霉素生物合成途径中的Dac M1都具有较高的序列相似性。对Ctc K进行二级结构预测发现其具有I类甲基转移酶典型的Rossmann-like超折叠结构,并且与同源蛋白的多序列比对发现Ctc K蛋白序列中具有富含甘氨酸的SAM结合保守基序。基于这些分析,初步推测Ctc K可能是一个SAM依赖的I类C-甲基转移酶。其次,利用PCR-targeting方法通过同源重组构建了ctc K遗传缺失菌株Δctc K。对Δctc K发酵产物的HPLC和Q-TOF分析发现该菌株不再产生金霉素和四环素,而是积累了去甲基四环素和去甲基金霉素,产量分别为50.7 mg/L和16.8 mg/L。为确认Ctc K的功能,对Δctc K进行了发酵产物的时间进程分析,并未检测到预期的pretetramid积累,暗示去甲基四环素和去甲基金霉素的合成是由Ctc K下游生物合成酶宽泛的底物耐受性造成的。为证实该推测,对ctc K进行了异源表达纯化,分别以去甲基四环素和去甲基金霉素为底物进行体外反应实验,并未检测到任何甲基化产物的生成。这些结果说明,Ctc K在金霉素生物合成早期负责C6甲基化。在此过程中,还发现去甲基四环素和去甲基金霉素在常温下由4S构型向4R构型的自发转化。最后,基于Δctc K突变株抗生素敏感性分析,分别构建了去甲基四环素和去甲基金霉素的代谢工程菌株。通过氯代酶基因加倍菌株中敲除ctc K,得到了相对高产去甲基金霉素的F3::3ctc PΔctc K菌株。该菌株中去甲基金霉素的产量为21.6 mg/L,相对Δctc K菌株产量提高了31%。与此同时,为构建只产去甲基四环素的工程菌株,尝试同时敲除ctc K和ctc P基因,并且已经成功构建了4种用于双基因敲除的质粒。总之,本研究利用体内基因敲除和体外蛋白酶活检测的方法,初步证实Ctc K负责金霉素生物合成早期中间体C6位的甲基化。得到的Δctc K丧失金霉素合成能力,而以去甲基四环素和去甲基金霉素为终产物,实现了不改变菌株遗传背景条件下去甲基四环素和去甲基金霉素生物合成菌株的构建。然后,利用对ctc K和ctc P的遗传操作构建了去甲基金霉素高产菌株,并完成了用于构建以去甲基四环素为唯一终产物的代谢工程菌株的质粒,为后期该菌株构建奠定了重要基础。本论文是通过定向改造实现重要活性产物合成的成功实例,为去甲基四环素和去甲基金霉素高产工业菌株的构建奠定了基础。