乳腺癌是威胁全球女性生命健康的头号癌症,转移是乳腺癌患者死亡的首要原因,一旦发生转移,治愈率很低。抗肿瘤免疫治疗是目前的研究热点。不同于传统单靶点的药物治疗,热物理治疗通过温度变化从整体上作用于肿瘤组织,可以激发机体抗肿瘤免疫响应,但其机制并不清晰。系统性研究热物理治疗转移性乳腺癌激发的抗肿瘤免疫机制,不仅需要选择合适的动物肿瘤模型,还需依赖高通量的分析技术。源于同一小鼠的自发乳腺癌系列细胞(67NR、168FARN、4T1)依次展现了乳腺癌转移的各个阶段,其中4T1是少数能代表人体乳腺癌转移全过程的细胞。近年来,高通量、高灵敏度、高选择性的蛋白组学技术,在大规模复杂生物样本中的研究颇具优势。因此,本论文借助多种蛋白组学技术,首先从分子水平上研究4T1系列乳腺癌细胞的转移特性,尤其是4T1细胞,为热物理治疗选择合适的肿瘤模型提供理论支持。随后我们建立了自发转移的小鼠4T1乳腺癌模型,针对热物理治疗转移性乳腺癌激发的抗肿瘤免疫机制展开深入研究,为转移性乳腺癌的治疗开拓新的思路。首先,基于细胞膜蛋白组学,研究4T1系列乳腺癌细胞的转移特性。我们建立了基于生物素-亲和素的捕获方法,将膜蛋白的富集效率提高至79%,高于以往文献报道的效率。随后,利用非标定量的鸟枪法蛋白组学技术,分析3株4T1系列乳腺癌细胞间的差异膜蛋白。我们一共鉴定到1677个膜蛋白(79.07%),其中472个为差异膜蛋白,且代谢相关蛋白富集程度最高。代谢相关差异蛋白中,12个蛋白的表达趋势随转移能力增强逐渐上升或下降。我们发现脂肪酸合成酶(FASN)及NAD(P)依赖的类固醇脱氢酶样蛋白(NSDHL)在4T1系列乳腺癌细胞中,亚细胞定位逐步从胞内转移至细胞膜,且该异位能力随细胞转移能力增强。我们利用Western blot及细胞免疫荧光技术证实了上述现象。这种与转移能力一致的蛋白亚细胞定位的变化,提示FASN及NSDHL在4T1系列乳腺癌细胞,尤其是4T1细胞转移特性中的重要作用,可能作为衡量其恶性程度的分子标志物。从分子水平上研究4T1系列乳腺癌细胞的转移特性,有利于我们更深入了解该细胞系的转移能力,为后续冷热交替治疗建立合适的肿瘤模型奠定理论基础。接着,我们建立自发转移的小鼠4T1乳腺癌模型,基于i TRAQ标记的鸟枪法蛋白组学技术,系统性研究了热物理(冷热交替)治疗转移性乳腺癌激发的抗肿瘤免疫机制。利用hydrazide chemistry技术,我们高效富集了血清糖蛋白(>90%)。通过i TRAQ标记及Offgel分离,我们一共鉴定到308个糖蛋白,其中231个糖蛋白被定量,53个糖蛋白被定义为差异蛋白。差异蛋白的信号通路分析发现,急性应激响应通路富集程度最高。聚类分析显示,冷热交替治疗引发的生物学响应具有时间特征,而急性应激响应是其率先引发的生物学事件。随后,基于高灵敏度、高选择性的PRM靶向蛋白组学技术,联合ELISA血清检测、RT-PCR及流式细胞技术,我们系统性探索了冷热交替治疗介导的急性应激响应与抗肿瘤免疫间的关系。我们对94份血清,23个差异糖蛋白在8个时间点上的表达展开了大规模验证。研究发现,冷热交替治疗激发了机体快速、强烈的急性应激响应,伴随着一系列急性应激蛋白短时间内高水平的表达,扭转了机体内肿瘤介导的慢性炎症环境,打破了Th2型的肿瘤免疫抑制生态圈。急性应答微环境激发DC细胞成熟、Th1型记忆型细胞增殖,诱导机体产生Th1型抗肿瘤免疫效应,最终消退原位肿瘤,有效抑制远端肿瘤的形成和发展。最后,我们探索了冷热交替治疗激发的急性应激响应在抗肿瘤免疫中的特异性。我们分别比较了冷热交替作用于健康和荷瘤小鼠,以及不同热物理治疗(单冷、单热、冷热交替)在荷瘤小鼠中引发的急性应激响应及相应的免疫效应。结果表明,冷热交替作用下的健康小鼠,其急性应激响应程度远远低于荷瘤小鼠,且无法有效激发T淋巴细胞响应,说明冷热交替治疗激发的急性应激响应及机体的抗肿瘤免疫效应与原位肿瘤组织的破坏及其特异性抗原、细胞因子释放相关。另外,相比单冷、单热,冷热交替激发了荷瘤小鼠体内最强的急性应激响应,伴随着显著的T淋巴细胞应答,最大程度抑制了MDSC骨髓衍生性抑制细胞的累积。我们过去的研究已发现,冷热交替模式较单冷、单热能更加彻底地破坏肿瘤组织,促进肿瘤组织释放更多特异性抗原、细胞因子,结合之前的研究结果,我们认为冷热交替能够营造更强的炎性环境,使肿瘤微环境发生更剧烈的变化,从而有效激发急性应激响应,最终引发更强的抗肿瘤免疫效应。综上,本论文基于高通量的蛋白组学技术,基于4T1细胞建立自发转移的小鼠乳腺癌模型,系统性地研究了冷热交替治疗转移性乳腺癌激发的抗肿瘤免疫机制,并发现冷热交替模式能够激发机体较强的急性应激响应,最终更有效地产生抗肿瘤免疫效应。这些发现可以帮助我们更深入地研究治疗转移性乳腺癌的有效方法,最终推进热物理免疫治疗的临床应用。