肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157：H7是一种重要的新发传染病病原菌。自1975年被首次分离、1982年被确认为致病菌以来的20多年中，世界各地包括中国都有不同规模的暴发流行。EHEC O157：H7感染可使人患腹泻、出血性结肠炎(hemorrhagic colitis, HC)，还可在5～10％的病例中引发溶血性尿毒综合征(hemolytic uremic syndrome, HUS)及血栓性血小板减少紫癜(thrombotic thrombocytopenic purpura, TTP)等严重并发症，严重者可导致死亡。EHEC O157的感染因具有暴发流行趋势、强烈的致病性与致死性和抗生素治疗可加剧病情的危险性等特点，已经成为全球性的公共卫生问题。目前EHEC O157：H7的全基因组测序已经完成，但对其感染仍缺乏有效的防治方法，研究证明：抗生素可促使O157菌释放致死性志贺毒素(Stx)，从而使患者并发HUS的危险性增加。人类同传染病斗争的历史表明，疫苗是人类战胜传染病的有力武器。由于O157的暴发流行和治疗上的困难，疫苗研究就显得尤其紧迫。 O157：H7及其它出血性大肠杆菌的致病性主要体现于细菌的粘附定植和产生毒素两个方面。紧密粘附素(Intimin)介导细菌与肠上皮细胞的紧密粘附，是O157最主要的定植因子，尤其是它的C端1／3部分(Intimin-C)为胞外功能区，与相应受体结合，且具有良好的免疫原性和免疫保护性，是理想的疫苗备选抗原。 EHEC O157主要产生两种毒素，分别称为志贺毒素Ⅰ(Stx1)和志贺毒素Ⅱ(Stx2)。在细菌体内，Stx2为分泌型表达，Stx1为胞内表达。两种毒素均由1个A亚单位和5个B亚单位组成，A亚单位具有细胞内毒性，能与28S rRNA作用从而抑制蛋白质合成，是大肠杆菌O157：H7引起临床表现的病理基础；B亚单位具有细胞结合特性，能与具有特定受体(Gb3)的细胞结合，从而引导A亚单位发挥作用。多数O157：H7细菌产生Stx2，而且Stx2毒性强于Stx1，与溶血性尿毒综合征(HUS)及血栓形成性血小板减少性紫癜(TTP)等严重并发症的相关性更为密切。因此Stx2是该菌致病性的重要物质基础。Paola Marcato等克隆表达了志贺毒素Ⅱ结合亚单位(Stx2B)并探索了其免疫保护性，发现Stx2B无毒，且具有良好的免疫保护性，针对Stx2B的单克隆抗体具有阻断毒素的作用。Nacilla H等人研究提示，痢疾志贺菌志贺毒素B亚单位(stxB)因能与具有Gb3受体的抗第三军医大学硕士学位论文原递呈细胞—树突状细胞(dendritic cells，DC)结合，有助于疫苗抗原的递呈和诱导细胞及体液免疫应答，显示了良好的免疫佐剂活性。与StxB亚单位结构功能类似，且结合受体一致的StxZB是否具有佐剂作用就很值得探讨。 基于以上认识，本实验拟从以下几个方面进行肠出血性大肠杆菌0157:H7(EHEc0157:H7)紧密粘附素免疫保护性片段(玩ti而nC300)及其与StxZB融合蛋白基因工程疫苗的实验研究。 1.对 0157:H7的IntiminC300进行基因克隆表达、初步纯化和动物免疫试验。设计引物采用PCR法自0 1 57菌基因组扩增Inti而nC3OO的编码基因eae一e300，T一A克隆后构建原核表达质粒pET一28a(+)一eaeC300，经测序鉴定后转化E.eoli BLZI(DE3)，IPTG诱导表达，队GE电泳检测。目的蛋白经包涵体洗涤和阴离子交换柱初步纯化后免疫家兔。结果显示PCR法自0 157菌基因组扩增出了约900bP的目的片段;原核表达质粒pET一28a(+)一eaeC经酶切及测序鉴定与预期序列一致。转化E.coh BLZI(D E3)后IPTG诱导目的蛋白表达率约30%;PAGE电泳初步测定目的蛋白的分子量约35KD，破菌后电泳证实目的蛋白以包涵体形式表达。经包涵体洗涤和阴离子交换柱初步纯化后目的蛋白纯度>80%，免疫家兔获得了较高效价的多抗血清，双扩效价为1:16，与O巧7菌的凝集效价达到1:128。 2.对O巧7:H7的StxZB进行基因克隆表达。同上设计引物采用PCR法自O巧7菌基因组扩增stxZB的编码基因stxZb，T一A克隆后构建原核表达质粒pET一1 Ic一stxZb，经测序鉴定后转化E.eoli BLZI(DE3)，IPTG诱导表达，队eE电泳检测。结果显示PCR法自。巧7菌基因组扩增出了约30Obp的目的片段;原核表达质粒pET一Ik一stxZb经酶切及测序鉴定与预期序列一致。转化E.coh BL21(D E3)后IPTG诱导目的蛋白表达率约10%;PAGE电泳初步测定目的蛋白的分子量约10KD。 3.构建EHEC 0 157:H7 Inti而nC300及StxZB的融合蛋白。在己构建原核表达质粒pET一28a(+)一eaec30o的基础上，将EHEC ol57stxZB的编码基因和玩ti而ne300基因相连接。连接的方式是:stxZB编码基因位于5’端，通过Linker(编码GGGGs的一段核昔酸序列)与Inti而nC300的编码基因连接，在融合基因的3’端连接6聚组氨酸编码序列。具体步骤为:设计带Ncol和Ndel酶切位点并加入Linker编码序列的引物克隆stxZb基因至pMD一18T载体，将其与含有Inti而nC30o编码基因的pET一28a(+)重组质粒同样以Ncol和Ndel双酶切，所需目的基因与载体片段的酶切产物经电泳回收纯化后，用DNA连接酶连接，获得pET一28a(+)一stxZb一eaeC30o重组质粒，再转化大肠杆菌DH5a，提取质粒酶切及测序鉴定后转化E.coh BL21(DE3)。IPTG诱导表达，第三军医大学硕士学位论文PAGE电泳检测。目的蛋白经包涵体洗涤和阴离子交换柱初步纯化。