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食管癌是一种侵袭性很强的恶性消化道肿瘤,其对传统的放疗、化疗以及外科手术都有很强的抵抗力。最新的肿瘤发生、发展分子生物学信息可能为食管癌的治疗策略的选择提供新视野。近年的研究发现环氧合酶-2(COX-2)与多种肿瘤的癌变有关,并且抑制COX-2可以使多种表达COX-2的恶性肿瘤细胞株生长受到抑制。本研究旨在探讨,顺铂、COX-2抑制剂NS-398以及顺铂联合NS-398对体外培养的食管癌Ec-109细胞增殖和凋亡的影响。为了初步观察顺铂以及联用NS-398对Ec-109细胞的作用,本实验首先在倒置显微镜下观察了顺铂和顺铂联合NS-398对Ec-109细胞生长状态的影响,结果发现随着顺铂和添加NS-398浓度的增加Ec-109细胞密度逐渐变低,散在分布,细胞内颗粒增多,出现细胞漂浮和细胞碎片。接着采用CCK-8法检测不同浓度的顺铂(1.25,2.50,5.00,10.00,20.00 mg?L-1)单用及顺铂联合NS-398(1.00,10.00μmol?L-1)作用Ec-109细胞24 h的细胞增殖抑制率;利用Annexin V-FITC和PI双染流式细胞术检测顺铂(1.25, 2.50, 5.00, 10.00, 20.00 mg?L-1)单用以及联合NS-398(10.00μmol?L-1)作用Ec-109细胞24 h的早期凋亡情况;琼脂糖凝胶电泳技术检测顺铂(1.25m, 2.50, 5.00 mg?L-1)单用及联合NS-398(1.00,10.00, 80.00μmol?L-1)作用Ec-109细胞48 h的DNALadder出现情况;并在透射电镜下观察了顺铂单用以及顺铂联合NS-398对细胞形态的影响。实验中,为探讨顺铂和NS-398协同效应的可能机制,我们进一步运用流式细胞术检测了顺铂(1.25,2.50,5.00,10.00,20.00 mg?L-1)单用及联合NS-398(1.00,10.00μmol?L-1)作用于食管癌Ec-109细胞24h的细胞周期改变。运用流式细胞术和免疫组化检测了顺铂及顺铂联合NS-398作用Ec-109细胞24 h后COX-2、Bax和Bcl-2蛋白的表达。利用Rhodamine 123标记细胞,流式细胞术检测顺铂(1.25, 2.50, 5.00, 10.00mg?L-1)单用及联合NS-398(10.00, 40.00μmol?L-1)作用Ec-109细胞24h后线粒体跨膜电位的变化。实验中我们发现,顺铂、NS-398对Ec-109细胞有剂量依赖性抑制增殖作用(P<0.05)。顺铂联合NS-398用药组细胞增殖抑制率明显高于同浓度顺铂单用组,且与添加的NS-398的剂量的增加而增加。AnnexinV-FITC和PI双染检测细胞早期凋亡的实验结果显示顺铂有剂量依赖性的诱导细胞凋亡和促进细胞死亡作用,在同样浓度的顺铂添加了10.00μmol?L-1 NS-398后,二者协同对Ec-109细胞的诱导凋亡和死亡作用强于同浓度的顺铂对Ec-109细胞的作用,差异有统计学意义(P<0.05)。琼脂糖凝胶电泳实验结果显示顺铂、NS-398及二者联合应用于食管癌Ec-109细胞48 h,均检测到DNALadder,且顺铂添加不同剂量的NS-398后,DNA梯状条带的亮度明显亮于同浓度的顺铂组,且梯状条带的亮度与添加的NS-398的剂量呈正相关。透射电镜观测到顺铂及NS-398作用于Ec-109细胞24 h,Ec-109细胞体积变小,呈现凋亡现象,主要为异染色质增多,染色质浓缩成团块,边集在核膜下,呈现半月形,细胞质中细胞器减少,溶酶体增多,胞质水肿,出现空泡,逐渐形成凋亡小体,部分可见核碎裂。细胞周期结果显示:顺铂、NS-398及联合作用组作用Ec-109细胞24 h后,与对照组比较,均能够阻滞细胞周期的进程,顺铂将Ec-109细胞阻滞于S期,NS-398将Ec-109细胞阻滞于G0/G1期。顺铂和NS-398均可诱导食管癌Ec-109细胞发生凋亡,顺铂添加NS-398后,细胞凋亡效应增加。免疫细胞化学和FCM结果都显示顺铂和NS-398作用组COX-2蛋白的表达较对照组表达量降低,Bcl-2蛋白表达也降低,Bax蛋白的表达含量升高,顺铂与NS-398联合组效应大于顺铂单用组的效应。FCM检测线粒体跨膜电位的实验结果显示对照组Ec-109细胞的荧光强度最强,顺铂及顺铂和NS-398作用Ec-109细胞24 h的线粒体跨膜电位随着顺铂浓度的增高和添加NS-398浓度的增高,线粒体跨膜电位降低,与对照组相比明显降低,差异具有统计学意义(P<0.05),且顺铂与40.00μmol?L-1 NS-398联合组与顺铂单用组及顺铂联合10.00μmol?L-1NS-398组相比,差异具有统计学意义(P<0.05),二者具有协同作用。COX-2抑制剂NS-398、顺铂对食管癌细胞都具有生长抑制效应,且呈浓度依赖性关系。而且两药联合应用时,NS-398明显增强了同样浓度的顺铂对Ec-109细胞的生长抑制及诱导凋亡的作用,两者联合应用具有明显协同效应。顺铂联合COX-2抑制剂NS-398的抗肿瘤机制与抑制细胞周期以及启动或者增强线粒体相关的凋亡途径有关。研究为COX-2选择性抑制剂联合DDP等化疗药用于指导临床化疗提供了实验依据,也为临床在不降低疗效的前提下,减少化疗药物用量带来了希望。