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上皮细胞通过细胞极性和细胞间粘附和紧密连接而发挥功能,但同时也限制了迁移的能力。研究发现,上皮细胞在一些因素的作用下,可发生细胞极性和细胞间粘附或紧密连接的丢失,并得浸润性游走迁移能力,被称为上皮间质转变(epithelial to mesenchymal transition),即EMT。EMT与恶性上皮性肿瘤的发生发展密切相关。近年来发现,肿瘤干细胞(Cancer stem cells, CSCs)也具有EMT能力。我们的前期研究已成功分离、鉴定了上皮性卵巢癌肿瘤干细胞样细胞(CSC-LCs),并初步发现了该细胞的EMT特征。尽管卵巢癌细胞化疗耐药与上皮间质转变之间的关系已经有相关文献报道,且肿瘤干细胞的耐药能力也在先前的研究中得到了证实,但是对卵巢癌肿瘤干细胞本身如何发生EMT的研究还有待完善。原癌基因Cyclin D1在维持肿瘤细胞未分化状态及非锚着悬浮生长中发挥着关键的作用,且多项研究发现Cyclin D1与多种实体肿瘤的远处转移及预后不良密切相关,我们推测该基因在维持卵巢癌肿瘤干细胞自我更新和EMT能力中可能发挥着重要作用。本研究以卵巢腺癌细胞系3AO为模型,从细胞增殖、细胞凋亡、干细胞相关基因表达分析等对CD24-表型细胞的肿瘤干细胞特征进行更深一步的验证,并对CD24-细胞的形态学、生物学特性及Cyclin D1可能的作用进行观察研究。旨在阐明卵巢腺癌细胞系3AO中肿瘤干细胞样细胞的间质细胞特征并具备EMT能力,而Cyclin D1参与其中并发挥了重要作用,提示肿瘤干细胞样细胞的EMT过程参与卵巢癌的侵袭转移的重要性。第一部分人卵巢癌CD24-表型细胞的干细胞特征的体外研究目的：通过比较CD24-与CD24+细胞的增殖、凋亡能力和分析干细胞相关基因Bmi-1和Oct-4的表达,阐明人卵巢癌CD24-表型细胞的干细胞特征。方法：利用无血清微球体培养法获得3AO肿瘤干细胞样悬浮球体,利用流式细胞分选法分选CD24-及CD24+细胞亚群,采用MTT法检测增殖能力,PE-FITC-PI三色荧光标记法检测不同亚群细胞耐受化疗药物诱导凋亡的能力,Real-time PCR法检测干细胞相关基因Bmi-1和Oct-4的表达。结果：1.3AO细胞能在无血清条件下形成自我更新的悬浮球体；2.3AO细胞中CD24-亚群在低血清状态下比CD24+亚群具有更强的增殖能力；3.3AO细胞中CD24-亚群比CD24+亚群更能够耐受卡铂诱导的晚期凋亡；4.CD24-细胞高表达干细胞标记物Bmi-1,并且该基因随着细胞分化表达下调；5.Oct-4在CD24-和CD24+细胞中表达没有差异,但能随着细胞分化表达下调。结论：1.CD24-细胞能够在低血清环境中持续增殖,并且能够耐受化疗药物卡铂诱导的细胞凋亡,提示该表型细胞具有干细胞高增殖力的特性。2.干细胞标记物Bmi-1在CD24-细胞高表达,且随着分化表达下调,提示Bmi-1在维持卵巢癌CSC-LCs的自我更新能力中的作用具有特异性。3.干细胞标记物Oct-4在CD24-、CD24+细胞均高表达,且均能随着分化表达下调,在维持以CD24-为表型的卵巢癌CSC-LCs的自我更新能力中的作用不具备特异性。第二部分Cyclin D1参与维持卵巢癌肿瘤干细胞样细胞EMT能力的体外研究目的：探讨Cyclin D1在维持3AO细胞系中肿瘤干细胞样细胞EMT能力中的作用及可能的机制。方法：观察新鲜分选的CD24-和CD24+细胞在分化培养基条件下细胞形态的变化,划痕试验检测富集CD24-表型的悬浮球体细胞的迁移能力,Real-time PCR法检测EMT相关分子E-cadherin和Vimentin的表达。合成特异性靶向Cyclin D1的siRNA,转染入3AO球状细胞中,沉默Cyclin D1的表达,观察沉默后3AO悬浮球状细胞增殖、凋亡、迁移能力的变化以及EMT相关分子的表达改变。结果：1.CD24-细胞的形态具有间质细胞特点,随着分化重新形成铺路石样形态；2.富集CD24-表型的悬浮球体细胞具有更强的迁移能力；3.CD24-细胞缺失表达粘附分子E-cadherin,并且随着细胞分化重新获得表达；4.CD24-细胞高表达波形蛋白Vimentin,并且随着细胞分化表达下调。5. Cyclin D1沉默后球状细胞增殖能力下降；6. Cyclin D1沉默后球状细胞迁移能力下降；7. Cyclin D1沉默后球状细胞凋亡能力增加；8. Cyclin D1沉默后伴随着EMT相关分子N-cadherin和Vimentin的表达下调；结论：1.CD24-细胞具备EMT表型,并且该表型随着细胞分化会发生逆转。2. Cyclin D1能促进卵巢癌肿瘤干细胞样细胞增殖、迁移,抑制其凋亡,并诱导EMT相关表型改变,提示Cyclin D1参与维持卵巢癌肿瘤干细胞样细胞的EMT能力。