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目的:坏死性凋亡是一种可受调节的新型细胞死亡方式,具有和凋亡细胞相类似的信号机制,主要由受体相互作用的蛋白丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1/3(receptor interacting protein kinase 1/3,RIPK 1/3)和混合连接激酶结构域样蛋白(mixed lineage kinase domain-like protein,MLKL)介导。另外,坏死性凋亡还具有与坏死细胞相类似的形态特征,释放细胞内成分“损伤相关分子模式(damage associated molecular pattern,DAMP)”、细胞因子和趋化因子等,进一步加重机体的炎症反应;致使细胞质膜肿胀,使其通透性改变,选择性离子通道开放,最后导致细胞裂解死亡。近年来的研究表明,坏死性凋亡是缺血再灌注损伤(IRI)中不可缺少的一部分,参与了多种脏器或组织的缺血再灌注损伤,特异性抑制剂的应用可减轻由IRI引起的心脏、视网膜、肾脏、脑等器官的损伤。但目前,坏死性凋亡是否参与了缺血再灌注导致的下肢损伤还未明确。因此,我们将通过构建SD大鼠下肢缺血再灌注模型来评估坏死性凋亡参与下肢缺血再灌注损伤的病理生理过程,同时探讨其可能的作用。方法:1、构建SD大鼠的下肢缺血再灌注模型:健康成年SD雄性大鼠,250-300g,29只随机分成3组,对照组(Sham group)9只、缺血再灌注+坏死性凋亡抑制剂组(IR+Nec-1group)9只、缺血再灌注组(IR group)11只。每只大鼠称量体重,计算所需的麻醉剂量,1%苯巴比妥,用1 ml注射器取相对应量的苯巴比妥,腹腔内注射麻醉。将大鼠麻醉后仰卧固定于操作台上,用剪刀将大鼠右下肢的毛剔除,用碘伏进行皮肤消毒。于右下肢大腿根部触及股动脉搏动,在搏动最强处切开皮肤,逐层钝性分离皮下组织,充分暴露股动脉。Sham组大鼠在麻醉后仅仅暴露股动脉,不予任何处理;IR组及IR+Nec-1组均暴露股动脉,并用血管夹夹闭股动脉4h(期间大鼠处于麻醉状态);IR+Nec-1组在松开血管夹前1h、松开后1h、4h及8h均腹腔注射坏死性凋亡抑制剂(Nec-1)1 mg/kg。4h后松开血管夹,恢复下肢血流,缝合各组切口及皮肤,75%乙醇消毒后继续饲养。2、氧化应激及肌肉组织损伤相关酶活性的检测:缺血再灌注24h后,用1%苯巴比妥麻醉3组大鼠,仰卧固定于操作台上,用剪刀将大鼠胸前区毛发剔除,切开皮肤,逐层钝性分离出下腔静脉。采用肝素钠处理过的1 ml注射器于下腔静脉处取血,放至同样被肝素钠处理过的Ep管中。取血后2h内将各组大鼠下腔静脉血,4℃,3500r/min,离心机离心20min,取上层血清于干净的Ep管中,放至-80℃冰箱保存备用。分别用肌酸激酶(CK)、丙二醛(MDA)及超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒检测Sham组、IR组和IR+Nec-1组中CK、MDA及SOD的含量。3、Western Blot方法检测Sham组、IR组和IR+Nec-1组中坏死性凋亡相关蛋白(RIPK1及RIPK3)的表达情况:缺血再灌注24h后,用1%苯巴比妥麻醉3组大鼠,待下腔静脉血取完后,麻醉处死大鼠。将大鼠仰卧固定于操作台上,用剪刀将大鼠右下肢毛发剔除,切开皮肤,钝性分离各层,取各组大鼠的比目鱼肌组织。提取比目鱼肌组织总蛋白,Western Blot方法检测Sham组、IR组和IR+Nec-1组中坏死性凋亡相关蛋白(RIPK1及RIPK3)的表达水平。4、HE染色观察Sham组、IR组和IR+Nec-1组中比目鱼肌的组织结构变化情况。结果:1、氧化应激及肌肉组织损伤相关酶活性的检测:(1)与Sham组相比,IR+Nec-1组和IR组血浆中CK含量较多,并且IR组中CK含量高于IR+Nec-1组。提示两组肌肉组织缺血损伤较Sham组重,加入坏死性凋亡抑制剂Nec-1可减轻缺血引起的肌肉组织损伤。(2)与Sham组相比,IR+Nec-1组和IR组血浆中MDA含量逐渐增多。提示两组中氧化应激产生的脂质过氧化反应较Sham组重,加入坏死性凋亡抑制剂Nec-1可减轻机体因缺血产生的氧化应激。(3)与Sham组相比,IR+Nec-1组和IR组血浆中SOD含量较少,并且IR组中SOD含量低于IR+Nec-1组。提示两组中生成了较多氧自由基,清除氧自由基时消耗了较多的超氧化物歧化酶,使SOD含量减少,加入坏死性凋亡抑制剂Nec-1可减少机体因缺血产生的氧自由基。2、Sham组、IR组和IR+Nec-1组右下肢比目鱼肌组织中坏死性凋亡相关蛋白(RIPK1及RIPK3)的表达情况:(1)与Sham组相比,IR+Nec-1组和IR组中坏死性凋亡相关蛋白RIPK1的表达增多,但IR+Nec-1组明显低于IR组。(2)与Sham组相比,IR+Nec-1组和IR组中坏死性凋亡相关蛋白RIPK3的表达增多,但IR+Nec-1组明显低于IR组。3、Sham组、IR组和IR+Nec-1组中比目鱼肌的组织结构变化情况:(1)在Sham组,大鼠比目鱼肌组织的显微结构正常,其肌组织横纹清晰,肌纤维排列较整齐,肌肉组织间的空隙无水肿,各肌束之间的毛细血管未见明显扩张,未见明显的炎症细胞浸润。(2)在IR+Nec-1组,大鼠比目鱼肌组织的肌组织纤维排列整齐,结构基本完整,肌肉组织间的空隙轻度水肿,各肌束之间的毛细血管轻度扩张,可见少许的炎症细胞浸润。(3)在IR组,大鼠比目鱼肌组织的肌纤维排列紊乱,肌肉组织间的空隙明显水肿,各肌束之间的毛细血管明显扩张,可见明显的炎症细胞浸润。结论:1、下肢股动脉缺血4h再灌注24h可导致大鼠比目鱼肌组织结构改变,坏死性凋亡相关蛋白RIPK1和RIPK3表达上调。2、坏死性凋亡参与大鼠缺血再灌注导致的下肢损伤,显微结构改变主要特征为细胞水肿和炎症细胞浸润。3、坏死性凋亡特异性抑制剂Nec-1的预先给药可降低缺血再灌注后比目鱼肌组织RIPK1和RIPK3表达,减轻细胞水肿和炎症细胞浸润,保护组织细胞。