【摘 要】
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目的磷脂酰乙醇胺结合蛋白4（Phosphatidylethanolamine-binding protein,PEBP4）是PEBP家族中的一员,参与了包括神经发育、肌细胞分化、精子发生、细胞膜合成和细胞凋亡等多种生物学过程,但PEBP4是否影响炎症的发生目前国内外尚未见报道。本研究的目的为验证PEBP4在慢性非细菌性前列腺炎（chronic non-bacterial prostatitis,C
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目的磷脂酰乙醇胺结合蛋白4（Phosphatidylethanolamine-binding protein,PEBP4）是PEBP家族中的一员,参与了包括神经发育、肌细胞分化、精子发生、细胞膜合成和细胞凋亡等多种生物学过程,但PEBP4是否影响炎症的发生目前国内外尚未见报道。本研究的目的为验证PEBP4在慢性非细菌性前列腺炎（chronic non-bacterial prostatitis,CNP）中的表达及其潜在的分子作用机制。方法1.验证PEBP4在CNP中的表达（1）免疫组化分别检测前列腺增生患者和前列腺增生合并CNP患者的前列腺组织PEBP4蛋白的表达水平,结合患者临床资料,分析PEBP4表达水平与前列腺炎患者临床病理特征关系。2.构建并验证PEBP4-/-小鼠稳定遗传（1）为了进一步探究PEBP4基因与CNP的关系,我们拟构建PEBP4-/-小鼠。C57BL/6品系小鼠是CNP常用模型的选择,基于实验的可靠性以及可操作性,我们将选择C57BL/6N品系小鼠作为我们构建转基因小鼠的动物来源来探究PEBP4与CNP的关系。构建PEBP4基因敲除小鼠的任务委托广州赛业生物科技有限公司。按照实验方案,利用Cre-lox P系统,敲除编码外显子,由其培育获得F0杂合子小鼠,我们进一步培育得到F1代杂合子和纯合子小鼠。（2）通过genotyping PCR实验及蛋白印迹（Western Blot）实验验证成功构建PEBP4-/-转基因小鼠。（3）观察PEBP4与血浆雄激素及每胎产仔数的关系3.探索PEBP4对CNP炎症细胞浸润的影响（1）通过肉眼观察小鼠前列腺、精囊病变情况（2）通过H＆E染色实验观察小鼠前列腺、精囊和睾丸炎性细胞浸润情况4.探索PEBP4引起CNP的分子机制（1）通过CRISPR-Cas9技术在人前列腺RWPE-1细胞中敲除PEBP4,筛选稳定细胞培养,提取总蛋白,采用Western blot实验检测PEBP4基因敲减效率。（2）经NF-κB通路的刺激物TNF-α刺激人前列腺细胞RWPE-1及PEBP4-/-人前列腺细胞RWPE-1后,通过Western blot实验检测NF-κB通路的关键信号分子p65、IκB以及它们的磷酸化分子p-p65、p-IκB,检测关键信号分子TRAF6的泛素化水平。结果1.免疫组化实验显示PEBP4在BPH患者前列腺组织中呈高表达,而在BPH合并CNP患者前列腺组织中呈低表达。2年期间随访发现高PEBP4表达的BPH患者的CNP发病率高于低PEBP4表达的患者。另外,BPH合并CNP患者出院后,高表达PEBP4的病人CNP复发率高于那些低表达PEBP4的病人。2.进行genotyping PCR扩增目的基因,后行琼脂糖凝胶电泳,曝光后得到条带。选取小鼠睾丸组织,进行Western-blot验证。结果发现,在PEBP4-/-小鼠睾丸中PEBP4几乎不表达,而在PEBP4+/+小鼠睾丸组织中,PEBP4却正常表达。通过genotyping PCR和Western blot实验结果,我们认为成功构建PEBP4基因敲除小鼠。另外,肉眼观察发现,PEBP4-/-小鼠精囊组织颜色较深,充血水肿。3.H＆E染色观察到PEBP4-/-小鼠的前列腺、精囊、睾丸组织大量炎细胞浸润。4.RWPE-1细胞通过CRISP-Cas9技术敲除PEBP4基因后,Western blot实验显示PEBP4蛋白水平降低,表明PEBP4敲除的RWPE-1细胞构建成功。5.Western Blot实验显示PEBP4敲除后,人前列腺细胞RWPE-1的NF-κB蛋白水平上升,TRAF6泛素化水平上升。给予不同浓度TNF-α刺激后发现,p65、IκB的磷酸化水平增加。结论1.PEBP4在CNP患者中低表达,且低表达水平与更高的CNP发病率、CNP患者更高的复发率有关。2.敲除PEBP4能促进小鼠前列腺、精囊、睾丸组织的炎细胞浸润,有可能在CNP发生、发展中发挥作用。3.PEBP4可通过激活NF-κB信号通路来促进CNP炎症细胞的浸润。PEBP4可能是CNP的潜在生物学标志物,有望成为CNP预防、诊断及治疗潜在靶点。
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