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WRKY转录因子和MAPK家族都被证明参与调控植物生物及非生物胁迫反应。许多研究说明WRKY转录因子在功能上处于MAPK级联途径的下游。
本实验室前期结果证明水稻OsMPK3和OsMPK20-4可以与OsWRKY30在酵母中相互作用。为了进一步研究MAPK家族的其他代表性成员是否也能直接调控OsWRKY30,我们克隆了分属于不同组的4个OsMAPK基因,包括OsMPK4、OsMPK7、OsMPK14和OsMPK20-5。随后我们检测了这4个OsMAPK与OsWRKY30的相互作用。基于本实验室前期结果和本文的数据,我们已经分析了7个OsMAPK,其中6个可以与OsWRKY30相互作用。这些OsMAPK分属于水稻MAPK家族的4个组,分别是OsMPK3(A组),OsMPK4(B组),OsMPK7和OsMPK14(C组),OsMPK20-4和OsMPK20-5(D组)。
为了检测MAPK是否能将OsWRKY30磷酸化,将与组氨酸标签融合的OsMPK3和OsWRKY30分别在大肠杆菌中表达并纯化。通过体外磷酸化实验,我们发现OsMPK3可以自我磷酸化,这与之前的报道是一致的。单独的OsWRKY30没有表现出任何磷酸化反应,但是当OsWRKY30与OsMPK3共同反应后,可以检测到明显的OsWRKY30磷酸化条带。所以,我们认为OsMPK3可以在体外将OsWRKY30磷酸化。本实验室前期结果证明,含有SPTTG结构域的WRKY转录因子可以与MAPK相互作用,我们选择含有SPTTG功能域的OsWRKY80检测其是否能被OsMPK3磷酸化。与OsWRKY30相似,OsWRKY80也能被OsMPK3磷酸化。这些结果证明了含有SPTTG结构域的WRKY转录因子可能是潜在的MAPK底物。
SP位点(丝氨酸残基S和脯氨酸残基P)是MAPK的潜在磷酸化位点。OsWRKY30中有8个SP位点,其中4个是连续的。当部分sP位点突变为AP(丙氨酸A)时,我们发现突变的OsWRKY30的磷酸化程度明显减弱。当所有8个SP位点都突变以后,磷酸化反应消失了。结果说明OsWRKY30中的sP位点对磷酸化反应是非常重要的。本实验室前期结果证明OsWRKY30作为转录因子,具有转录激活活性,转录激活结构域在其N端区域。为了证明SP位点是否影响OsWRKY30的转录激活活性,我们将OsWRKY30进行点突变后构建到pGBKT7载体中。通过β-半乳糖苷酶活性分析,结果显示如果OsWRKY30或者其缺失片段中没有SP位点,其转录激活活性将消失。这些结果证明了SP位点同样在OsWRKY30转录激活功能中起重要作用。
大多数WRKY转录因子都能结合W-box,为了证明OsWRKY30转录因子能结合W-box,我们利用酵母单杂交系统做了检测。W-box的4个串联重复被插入到报告基因的上游,而OsWRKY30全长与GALA转录激活结构域融合。结合活性的强度通过β-半乳糖苷酶活性分析测定。结果显示pHISi-W-box/pGADT7-WRKY30组合可以在含有5和15mM3-AT的SD-His上生长,而pHISi-W-box/pGADT7组合却不能,说明OsWRKY30能结合W-box。