胶质瘤是人类中枢神经系统中最为常见的原发性恶性肿瘤,约占颅内肿瘤的40%~60%。目前对胶质瘤患者普遍采用手术切除联合术后放化疗等综合治疗方法。虽然近年来,神经影像技术、显微外科技术以及放化疗治疗方案等多方面均取得了突飞猛进的发展,但对于胶质瘤患者,尤其是高级别的胶质瘤患者,预后仍然不佳。胶质母细胞瘤(WHOⅣ级)患者术后复发率仍接近100%,中位生存时间少于1年。文献报道,低级别胶质瘤患者平均生存时间为3~5年,而高级别患者则是1~2年。治疗效果的不佳主要是由于胶质瘤细胞具有高度侵袭、增殖、迁移能力以及凋亡抑制的特性,决定了胶质瘤不可能单纯通过外科方法得到治愈,而目前的放化疗治疗也无法满意控制胶质瘤的发展。因此,深入了解胶质瘤发生发展机制,研究靶向药物以特异性地抑制甚至灭活残存瘤细胞,是未来胶质瘤治疗的方向。目前已经发现许多与肿瘤相关的基因及蛋白因子,有些已经研究的比较深入,一部分新型抗肿瘤药物已应用临床并显著改善预后。但是针对胶质瘤的药物研究大多仍处于实验的初级阶段,仍需进一步研究探索。mi RNA即微小RNA(microRNA),是一类新近发现的、内源性、非蛋白质编码RNA,因其在各种病理生理过程中的强大作用逐渐受到重视。文献指出,miR-95-3p在直肠癌、胰腺癌、乳腺癌及前列腺癌等癌症中具有致癌作用。考虑到miR-95-3p尚未在胶质瘤细胞中进行过研究,故在本实验中我们选取miR-95-3p作为对象,并通过MTT实验,流式细胞技术以及Transwell实验探讨其对于胶质瘤的作用。CELF2(CUGBP-and ETR-3-like family)为一组RNA连接蛋白,包含众多与基因转录后调控相关的蛋白。研究表明,CELF2编码基因位于10号染色体上,该染色体在60%的低级别胶质瘤中呈单体型,并在80%的高级别胶质瘤中部分缺失,我们因此猜测CELF2与胶质瘤的发生发展可能相关。由于CELF2出现在Targetscan的预测结果中,我们进一步研究其与miR-95-3p的关系。实验中我们通过荧光素酶报告基因实验确定mir-95-3p与celf2的靶向作用关系,并分析两者表达量的相关性进一步证实两者相关性。最后通过复活实验证实mir-95-3p对胶质瘤的作用是通过靶向调控celf2引起的。第一部分mir-95-3p在人脑胶质瘤组织中的表达及其与胶质瘤病理级别的相关性目的:研究mir-95-3p在人脑胶质瘤组织中的表达,并分析mir-95-3p的表达与胶质瘤病理级别的关系。方法:1组织标本的采集:35例胶质瘤样本及15例非肿瘤脑组织样本均于2014年采集自河北医科大学第二医院神经外科。包括19名女性,31名男性,年龄从18至68岁,共收集胶质瘤样本35例,其中Ⅰ级胶质瘤4例、ii级5例、iii级17例、iv级9例,均由术中切除获得。15例非肿瘤脑组织样本来自于对严重的脑外伤患者进行的颅内减压术。诊断结果均由2位病理医师根据who分级指导得出。所有样本在采集后立即保存至-80℃液氮中。2样本mir-95-3p表达水平的测定:反转录定量聚合酶链反应(qrt-pcr)方法测定35例胶质瘤样本以及15例非肿瘤脑组织样本中的mir-95-3p含量。3相关性分析:应用t检验分析胶质瘤中mir-95-3p含量与胶质瘤级别之间的关系。结果:1qrt-pcr结果:胶质瘤组织与非肿瘤脑组织中mir-95-3p表达量具有显著性差异。与对照非肿瘤脑组织相比,胶质瘤组织中mir-95-3p含量显著升高,差别具有统计学意义(p<0.001)。2t检验结果:低级别胶质瘤(whoⅠ、Ⅱ级)、高级别胶质瘤(whoⅢ、Ⅳ级)及非肿瘤脑组织中mir-95-3p表达量具有显著性差异。在高级别胶质瘤组织中mir-95-3p的含量较低级别更高。结论:1mir-95-3p在人脑胶质瘤组织中高表达,且其表达量随着胶质瘤级别的升高而升高。高级别胶质瘤mir-95-3p的表达量要高于低级别胶质瘤,差别具有统计学意义。2mir-95-3p的表达水平与胶质瘤的级别呈显著的正相关,提示mir-95-3p可能成为胶质瘤临床分级的分子标志物。第二部分mir-95-3p对胶质瘤细胞生物学活性的影响目的:研究mir-95-3p对u87和u251细胞的增殖、侵袭、凋亡及细胞周期等方面的影响。方法:1培养u87和u251细胞系用于体外功能学实验。向实验组中转染mir-95-3paso以降低细胞内mir-95-3p的表达。对照组转染ctrlaso。2进行mtt实验研究降低mir-95-3p表达后胶质瘤细胞增殖能力的变化。3进行流式细胞实验研究降低mir-95-3p表达后胶质瘤细胞周期及凋亡能力的变化。4进行transwell实验研究降低mir-95-3p表达后胶质瘤细胞侵袭能力的变化。结果:1qrt-pcr结果显示,转染mir-95-3paso后,u87及u251细胞内mir-95-3p的表达量显著降低(p<0.05)。2mtt实验结果显示,降低mir-95-3p表达后,u87及u251细胞增殖能力显著降低(p<0.05)。3流式细胞实验结果显示,降低mir-95-3p表达后,u87及u251细胞周期无明显改变,凋亡增殖能力显著增高(p<0.05)。4transwell实验结果显示,降低mir-95-3p表达后,u87及u251细胞侵袭能力显著降低(p<0.05)。结论:降低mir-95-3p表达,可以使u87及u251细胞增殖及侵袭能力显著降低,凋亡能力显著增高,细胞周期无明显差别。mir-95-3p可以影响胶质瘤细胞的增殖、侵袭及凋亡水平。第三部分celf2为mir-95-3p的下游靶基因目的:寻找mir-95-3p的下游作用靶点,进一步了解mir-95-3p对胶质瘤生物学影响的作用机制。方法:1使用在线工具targetscan预测mir-95-3p的下游作用靶点,并根据文献资料筛选结果。2双荧光素酶报告基因实验验证mir-95-3p与celf2的靶向作用关系。3应用反转录定量聚合酶链反应(qrt-pcr)及蛋白质免疫印迹(westernblot)方法检测mir-95-3p与celf2在u87及u251细胞中的表达量,并分析两者的相关性。结果:1根据targetscan的预测结果,并结合相关文献资料,猜测celf2上可能存在mir-95-3p的靶向作用位点。2相对于mir-95-3p反义寡核苷酸(mir-95-3paso),对照组中共转染mir-95-3p与ctrlaso可以显著抑制荧光素酶活性,而突变靶位点后此抑制作用消失。3mir-95-3p与celf2在u87及u251中的表达量呈负相关。结论:celf2的mrna中存在mir-95-3p在胶质瘤中的靶向作用位点。第四部分mir-95-3p通过调控celf2影响胶质瘤细胞增殖、侵袭、凋亡等的生物学活性目的:证实mir-95-3p对胶质瘤的生物学活性影响是通过调控celf2而完成的。方法:1向u251细胞内转染mir-95-3paso后,同时转染小干扰rna(smallinterferingrna,sirna),以降低细胞中celf2的含量。2进行mtt实验,实验组共转染mir-95-3paso与celf2sirna,对照组共转染mir-95-3p与ctrlsirna,检测u251细胞增殖能力的改变。3进行流式细胞实验,实验组共转染mir-95-3paso与celf2sirna,对照组共转染mir-95-3p与ctrlsirna,检测u251细胞凋亡能力的改变。4进行transwell实验,实验组共转染mir-95-3paso与celf2sirna,对照组共转染mir-95-3p与ctrlsirna,检测u251细胞侵袭能力的改变。1 Western blot实验证实转染CELF2 siRNA后,U251细胞内CELF2含量显著降低(P<0.05)。2 MTT实验结果显示,相对于对照组,实验组中U251细胞增殖能力明显降低(P<0.05)。3流式细胞实验结果显示,相对于对照组,实验组中U251细胞凋亡能力明显增高(P<0.05)。4 Transwell实验结果显示,相对于对照组,实验组中U251细胞侵袭能力明显降低(P<0.05)。结论:miR-95-3p是通过调控CELF2的表达而影响胶质瘤增殖、凋亡、侵袭能力改变的。