肿瘤微环境是肿瘤逃避免疫排斥和促进肿瘤发生和发展的一个重要保护屏障,也是肿瘤免疫治疗的一个瓶颈。肿瘤微环境构成一个复杂的网络:①肿瘤MHC、HLA、Fas分子、TSA、TAA等的表达改变或缺失;②肿瘤上调分泌IL-10、TGF-β1等免疫抑制细胞因子,下调分泌IL-2、IFN-γ等免疫效应细胞因子;③免疫抑制功能的调节T细胞(Tregs)在瘤内浸润增多④树突状细胞(DCs)功能不全或处于未成熟状态⑤热休克蛋白(HSPs)表达异常。Tregs的免疫抑制、DCs功能不全、HSPs异常表达对肿瘤微环境有重要的影响作用:1)Tregs特别是CD4~+ CD25~+ Foxp3~+ Tregs浸润增多促进肿瘤免疫抑制。叉头转录因子p3(Foxp3)在Tregs的活化与功能起到关键的作用,肿瘤分泌的细胞因子TGF-β、IL-10促进CD4~+ CD25~+ Foxp3~+ Tregs在肿瘤浸润:TGF-β诱导和维持CD4~+ CD25~+ Foxp3~+ Treg的抑制功能,诱导周围淋巴器官CD4~+ CD25- T细胞反转为抑制型CD4~+ CD25~+ T细胞;IL-10诱导CD4~+ CD25~+ Foxp3~+ Tregs增殖。CD4~+ CD25~+ Foxp3~+ Tregs通过细胞直接接触或分泌细胞因子①抑制CD4~+ T细胞、CD8~+ T的活化、增殖;②抑制B细胞的增殖、抗体产生和类型转换,③抑制NK细胞、NK T细胞的细胞毒性,④抑制DCs的成熟。2)肿瘤浸润的DCs,大部分为未成熟DCs(iDCs):①抗原呈递能力低;②与CD4~+ CD25~+ Foxp3~+ Tregs相互作用抑制免疫;③下调表达共刺激分子CD80、CD86;④上调表达ICOS、ILT3、ILT4与T细胞相应受体结合诱导初始T淋巴细胞转变为Tregs。3)肿瘤上调表达HSPs通过细胞保护和抑制调亡影响肿瘤的发生、发展、侵袭和转移。DCs是体内最有效的专职抗原递呈细胞,具有摄取、加工抗原,以MHC-I、II类肽结合的形式提呈抗原的能力。用不同的方式刺激DCs制成肿瘤疫苗已证实有抗肿瘤效应,本课题利用Hepal-6细胞裂解蛋白的全抗原性,结合热休克后提高HSPs表达,增强其免疫性。Hepal-6细胞热休克后提取蛋白致敏骨髓树突状细胞(BMDCs)制成瘤苗,体外研究瘤苗的抗肿瘤效应;将瘤苗注射荷瘤小鼠,观察瘤苗的体内抗肿瘤效应。主要方法和实验路线1.建立荷瘤小鼠模型,分离和鉴定小鼠脾、淋巴结和肿瘤内CD4~+ CD25~+ Foxp3~+ Tregs,FACS分析瘤内CD11c~+细胞、CCR7~+细胞、CD80~+细胞,CD86~+细胞的浸润。免疫组化(IHC)和western-bolt分析肿瘤内Foxp3、HSP70和HSP90的表达情况;Hep-6细胞热休克并提取蛋白。2.培养、诱导和鉴定C57BL/6J小鼠的BMDCs,并做成熟刺激实验;Hepal-6细胞热休克后裂解蛋白致敏BMDCs,分析刺激后BMDCs的CD11c、CCR7、CD80、CD86表达,IFN-γ的分泌,体外对T细胞的增殖效应和CTL作用,以及对Hepa-6细胞凋亡的影响。3.Hepal-6细胞热休克后裂解蛋白致敏的BMDCs瘤苗足垫和瘤内注射荷瘤小鼠,研究瘤苗对肿瘤的生长抑制;对瘤内免疫效应CD4~+ T细胞、CD8~+ T细胞活化和增殖效应;对CD11c~+细胞、CCR7~+细胞、CD80~+细胞,CD86~+细胞和CD4~+ CD25~+ Foxp3~+ Tregs浸润的影响;对瘤内免效应细胞因子和免疫抑制因子的影响;治疗后肿瘤组织内HSPs分子的表达改变。主要结果1.FACS检测结果显示,小鼠瘤内有较多的CD25~+ Foxp3~+ Tregs浸润,荷瘤小鼠脾和淋巴结的Foxp3~+ Tregs浸润增多;瘤内有CD11c~+细胞、CCR7~+细胞、CD80~+细胞,CD86~+细胞浸润;IHC和western-bolt检测结果示,瘤体内表达HSP70、HSP90、Foxp3~+蛋白。Hepal-6细胞热休克后,能上调表达HSP70。2.GM-CSF和IL-4诱导的BMDCs具有DCs表型,表达CD11c、CCR7、CD80、CD86等DCs相关分子;Hepal-6细胞热休克后裂解蛋白致敏的BMDCs上调表达CD11c、CCR7、CD80、CD86。3.Hepal-6细胞热休克后裂解蛋白致敏的BMDCs的IFN-γ分泌上调,向SLC趋化迁移的能力提高;体外能刺激T细胞的增殖,能促进T细胞的CTL效应;能促进Hepal-6细胞的凋亡。4.Hepal-6细胞热休克后裂解蛋白致敏的BMDCs瘤内和足垫注射后荷瘤小鼠后,平均瘤体体积和重量低于对照组;CD8~+ T细胞和CD4~+ T细胞在脾、淋巴结和肿瘤的浸润增多,瘤内CD11c~+细胞、CCR7~+细胞、CD80~+细胞,CD86~+细胞数量上升;肿瘤、脾、淋巴结内CD4~+ CD25~+ Foxp3~+ Treg浸润减少;肿瘤、脾、和淋巴结Foxp3分子表达下调;肿瘤内免疫抑制因子IL-10、TGF-β1分泌下调;免疫效应因子IL-2、IFN-γ分泌上调;初步检测的结果显示瘤内HSP70在治疗前后改变不明显。结论热休克能提高Hepal-6细胞HSPs表达,裂解蛋白体外致敏的BMDCs上调表达CD11c、CCR7、CD80、CD86分子;上调IFN-γ的分泌,迁移能力增强。裂解蛋白致敏的BMDCs体外能刺激T细胞的增殖,增强T细胞的CTL效应,对Hepal-6细胞的凋亡有促进作用。致敏的BMDCs疫苗瘤内注射后,能抑制肿瘤的生长;抑制免疫抑制细胞CD4~+ CD25~+ Foxp3~+ Tregs在肿瘤、脾和淋巴结的浸润;下调免疫抑制细胞因子IL-10、TGF-β在肿瘤的分泌,上调免疫效应细胞因子IL-2、IFN-γ的分泌;促进CD11c~+ DCs在瘤内浸润和成熟,促进CD4~+ T细胞、CD8~+ T细胞在脾、淋巴、肿瘤结内浸润。因此,Hepal-6热休克后裂解蛋白致敏的BMDCs瘤苗能优化肿瘤微环境的T细胞种群,促进瘤内CD11~+c DCs的浸润和成熟,改善微环境的免疫条件,促进肿瘤的免疫排斥,但是否对瘤内HSPs的表达有影响尚待实验进一步研究。创新点本研究的创新之处在于,利用肿瘤细胞裂解蛋白的全抗原,通过热休克提高HSPs的表达,提高肿瘤细胞免疫原性;提高BMDCs抗原递呈;减少免疫抑制细胞Tregs的浸润;促进CD4~+ T细胞、CD8~+ T细胞和NK T细胞的活化和增殖;促进免疫效应细胞因子的分泌;抑制免疫抑制因子的分泌。问题和展望由于HSPs在肿瘤的发生、发展、侵袭和转移过程中扮有重要角色,本研究通过热休克提高肿瘤细胞HSPs表达,热休克后提取的蛋白能促进BMDCs的成熟和抗原递呈能力,瘤苗在小鼠瘤内也有明显的抗瘤免疫效应。实验结果初步显示瘤苗治疗前后,HSP70的表达改变不明显,但还不足以解释瘤苗除了具有促免疫效应之外,是否对瘤内HSPs家族整体还是个别发生影响,以及这种影响在不同的肿瘤是否也差有异,因此,还要进一步研究确定。另外,HSPs在抗肿瘤细胞凋亡和促进肿瘤生长方面起关键作用,因此,用抗HSPs抗体或药物联合肿瘤热休克裂解蛋白致敏BMDCs瘤苗治疗可能是本研究的新方向。