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第一部分红霉素对烟草烟雾刺激下人巨噬细胞SIRT1的抗氧化应激作用目的:观察红霉素对烟草烟雾刺激下对人巨噬细胞SIRT1参与的氧化应激的调节,探讨红霉素的抗氧化应激机制。方法:选取人组织细胞淋巴瘤细胞(U937细胞)进行培养,在终浓度为200ng/ml的佛波酯(PMA)预孵育后将其诱导成人巨噬细胞,以诱导后的巨噬细胞为实验对象。将巨噬细胞分组处理:对照组、CSE组、CSE+红霉素(EM)组、CSE+NAM组、CSE+NAM+EM组;根据预实验结果,使用1%CSE、10μg/ml EM、0.02μmol/LNAM进行干预。使用DCFH-DA法检测细胞中ROS的释放水平;使用蛋白印迹法(WB)检测细胞中SIRT1蛋白的表达;使用荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)检测SIRT1 m RNA的表达;使用酶联免疫吸附剂测定法(ELISA)检测各组细胞上清液中氧化应激因子超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)的表达情况。结果:1.各组细胞中ROS的表达情况:与对照组相比,CSE刺激后人巨噬细胞释放ROS增加(P<0.05);EM预孵育24h后能够抑制巨噬细胞ROS的释放(P<0.05);与对照组,CSE+NAM组中ROS的释放上调(P<0.05),EM的预孵育后ROS释放降低(P<0.05)。2.SIRT1蛋白表达:与对照组相比,CSE组、CSE+NAM组中SIRT1蛋白的表达下调(P<0.05),红霉素预孵育24h能够上调SIRT1的表达(P<0.05)。3.SIRT1 m RNA表达情况:与对照组相比,CSE、CSE+NAM组SIRT1 m RNA表达水平降低(P<0.05),红霉素预孵育24h后能够上调SIRT1 m RNA的表达(P<0.05)。4.SOD的表达情况:与对照组相比,CSE刺激下细胞中SOD表达下调;与CSE组相比,CSE+NAM组细胞中SOD表达下降增加(P<0.05),红霉素预孵育24h后SOD的表达上调(P<0.05)。5.MDA表达情况:与对照组相比,CSE刺激下细胞中MDA表达增加;与CSE组相比,CSE+NAM组MDA表达明显增加(P<0.05),红霉素预孵育24h后MDA的表达水平降低(P<0.05)。结论:1.烟草烟雾刺激下引起人巨噬细胞SIRT1的表达下降,从而引起ROS释放增多,进而引起SOD表达下降,MDA表达上调水平升高,导致细胞中氧化应激反应增加。2.红霉素抗氧化应激机制可能是通过上调SIRT1的表达,从而抑制ROS的释放,进而引起SOD的表达上调并抑制MDA的表达,抑制细胞氧化应激反应。第二部分红霉素对烟草烟雾刺激下人巨噬细胞PPARγ的抗氧化应激作用目的:探讨红霉素对烟草烟雾刺激下人巨噬细胞PPARγ氧化应激的影响,探讨红霉素抗氧化应激机制。方法:选取U937细胞,使用PMA将其诱导成巨噬细胞后用作实验对象。实验分组:对照组、CSE组、CSE+EM组、CSE+GW9662组、CSE+GW9662+EM组。根据预实验结果,使用1%CSE、10μg/ml EM、10μmol/ml GW9662进行干预。使用DCFH-DA法检测ROS的释放水平;使用WB检测PPARγ蛋白的表达情况,使用RT-PCR检测PPARγm RNA的表达情况;使用ELISA检测上清液中SOD、MDA的表达情况。结果:1.与对照组相比,CSE组中ROS的释放水平升高(P<0.05),红霉素预孵育24h后ROS的表达降低,与对照组相比,CSE+GW9662组ROS的释放增加(P<0.05),红霉素预孵育24h能够降低ROS的表达(P<0.05)。2.PPARγ蛋白表达:与对照组相比,CSE组、CSE+GW9662组中PPARγ蛋白表达降低(P<0.05),红霉素预孵育后PPARγ蛋白的表达水平上升(P<0.05)。3.PPARγm RNA表达:与对照组相比,CSE组、CSE+GW9662组中PPARγm RNA的表达下调(P<0.05),与红霉素预孵育后PPARγm RNA的表达水平上调(P<0.05)。4.SOD表达情况:与对照组相比,CSE、CSE+GW9662组中SOD表达下降(P<0.05),与CSE组相比,CSE+GW9662组中SOD表达明显下降(P<0.05),红霉素能够上调SOD的表达(P<0.05)。5.MDA的表达情况:与对照组相比,CSE、CSE+GW9662组中MDA表达增加(P<0.05),与CSE组相比,CSE+GW9662组中MDA表达明显增加(P<0.05),红霉素预孵育后MDA的表达下降(P<0.05)结论:1.烟草烟雾刺激下人巨噬细胞中PPARγ表达降低,从而引起ROS表达升高,进而引起SOD表达下降,MDA表达水平升高,最终诱导氧化应激反应。2.红霉素能够通过上调PPARγ的表达,从而抑制ROS的表达,进一步促进SOD的表达,降低MDA的表达,从而抑制烟草烟雾引起的氧化应激反应。第三部分烟草烟雾刺激下人巨噬细胞中SIRT1、PPARγ之间关系和红霉素的作用目的:探讨PPARγ抑制剂GW9662对烟草烟雾刺激下人巨噬细胞中SIRT1表达的影响,探讨SIRT1、PPARγ之间的关系,及红霉素的抗氧化应激的可能作用机制。方法:选用PMA诱导后的巨噬细胞作为实验对象。实验分组:对照组、CSE组、CSE+EM组、CSE+GW9662组、CSE+GW9662+EM组,干预条件同第二部分。WB检测SIRT1蛋白的表达情况。RT-PCR检测SIRT1 m RNA的表达情况。采用Spearman相关分析法分析SIRT1、PPARγ之间的关系。结果:1.SIRT1蛋白的表达情况:与对照组相比,CSE刺激下人巨噬细胞中SIRT1蛋白表达降低,红霉素预孵育24h后能够SIRT1蛋白的表达上调(P<0.05)。与对照组相比,CSE+GW9662组中SIRT1蛋白表达下降(P<0.05),与CSE+NAM组相比,红霉素预孵育SIRT1的表达上调(P<0.05)。2.SIRT1 m RNA的表达情况:与对照组相比,CSE刺激下人巨噬细胞中SIRT1m RNA表达降低,红霉素预孵育24h后能够SIRT1m RNA的表达上调(P<0.05)。与对照组相比,CSE+GW9662组中SIRT1m RNA表达下降(P<0.05),与CSE+NAM组相比,红霉素预孵育SIRT1 m RNA的表达上调(P<0.05)。3.相关性分析:PPARγ与SIRT1蛋白、m RNA之间呈正相关关系(r=0.5920,p=0.006;r=0.8689,p<0.0001)。结论:1.GW9662抑制剂抑制PPARγ表达下,SIRT1表达上升,SIRT1可能是PPARγ的一个下游因子。2.烟草烟雾诱导的氧化应激反应可能通过PPARγ-SIRT1信号通路实现。3.红霉素抑制烟草烟雾引起的氧化应激反应可能通过调控PPARγ-SIRT1通路实现。