研究背景糖尿病(Diabetes mellitus)的患病率呈快速上升趋势,预计2030年我国将达1.297亿,糖尿病患者的血糖控制不稳将导致一系列多器官如眼、肾、心、骨骼肌、周围和中枢神经等并发症。2型糖尿病是一种主要由于胰岛素抵抗伴随相对胰岛素不足,或胰岛素分泌缺陷伴有或不伴有胰岛素抵抗而导致慢性高血糖的代谢疾病,占糖尿病总数的90%-95%。2型糖尿病患者大多体型肥胖,常伴有高脂血症,易于诱发后期的多种并发症。目前,用于治疗2型糖尿病的西药主要有磺酰脲类、噻唑烷二酮类、双胍类、格列奈类、α-葡萄糖苷酶抑制剂、二肽基肽酶IV抑制剂及胰岛素制剂等。西药治疗2型糖尿病注重于控制血糖,但仅仅控制血糖不能从根本上阻止糖尿病并发症的发生。祖国传统医学称糖尿病为消渴病,在治疗糖尿病及其并发症方面进行了大量的临床实践。中药具有祖国传统医药特色和良好的临床疗效,在糖尿病及其并发症的治疗上具有广阔的前景。中医药在治疗糖尿病,尤其是伴有高脂血症的糖尿病方面已经积累了丰富的经验,是进一步研究和开发新药的宝贵资源。由于传统中药及中药复方制剂的复杂成份经常展现出多种生物活性和不同的作用机制,中药单体成分治疗糖尿病的作用机制易于阐明,因此,中药单体成分在防治糖尿病研究方面正日益引起国内外学者关注。从现代药理研究和古代文献记载出发,筛选治疗糖尿病的中药单体成分是当今糖尿病防治研究领域的一个重要方向。寻找同时具有降糖调脂作用,且对糖尿病及其并发症有预防和治疗作用的抗糖尿病药物成为国内外研究的一个新热点。胡芦巴碱(Trigonelline)是胡芦巴种子的主要有效成分,也存在于紫茉莉根、南瓜的果实、咖啡豆及马铃薯中。胡芦巴碱具有降血糖、降低胆固醇、促进神经组织再生、抗癌、抗氧化、镇静等功效。流行病学研究显示习惯性地饮用咖啡可明显降低2型糖尿病发病风险,因为咖啡中胡芦巴碱含量可达到1%,即平均每杯咖啡的胡芦巴碱量约53mg。胡芦巴碱能降低肥胖2型糖尿病KK-Ay小鼠的空腹胰岛素水平和肝脏、脂肪中甘油三酯含量,增加肝脏葡萄糖激酶／葡萄糖-6-磷酸酶比例,降低肿瘤坏死因子a水平。胡芦巴碱还能抑制一种伴有非肥胖2型糖尿病Goto-Kakizaki大鼠甘油三酯的积累及糖尿病的进展。体外实验表明胡芦巴碱具有抗氧化功效。胡芦巴碱呈剂量依赖性地抑制p淀粉样蛋白25-35引起的神经元树突和轴突萎缩,促进大脑皮层神经元树突和轴突再生,具有保护中枢神经元的作用。神经营养因子产生和支持减少是导致糖尿病轴突再生障碍和神经病变发病机制之一。Neuritin(又名可塑性相关候选基因15,Candidate plasticity-related gene15, CPG15)是神经营养因子的一个新成员,主要分布于脑组织,在促进神经元树突和轴突的生长和分支、调节神经元回路的形成、防止神经元凋亡和保护神经元等方面具有重要作用。丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase, MAPK)通路是胰岛素两条主要信号转导通路之一,主要包括ERK/MAPK、JNK/MAPK, p38/MAPK三条信号通路,在中枢神经系统广泛表达。糖尿病时单独高糖或高糖与其他因素共同作用,产生各种细胞外刺激激活MAPK信号转导通路,而MAPK活化与糖尿病神经病变密切相关。与ERK1/2能保护神经元相反,JNK和p38MAPK通常引起神经元凋亡。胡芦巴碱具有降血糖和神经保护作用,neuritin与糖尿病神经病变发病机制密切相关,MAPK是高糖损伤神经的传感器,参与糖尿病神经病变的发生。神经营养因子调节的神经保护和可塑性往往涉及到MAPK信号通路。鉴于以上分析,本课题将开展胡芦巴碱对2型糖尿病大鼠糖脂代谢作用的研究,并初步探讨海马中neuritin表达及MAPK信号通路在胡芦巴碱抗2型糖尿病中的作用。本课题的完成,为胡芦巴碱用于抗2型糖尿病提供理论依据,有利于促进胡芦巴碱的开发、研究和应用。也为以廉价中药为基础,探索和开发出新型天然抗糖尿病的药物提供一种思路。研究目的1.通过一次性快速腹腔注射小剂量链脲菌素(Streptozotocin)加高糖高脂饲料喂养建立实验性2型糖尿病大鼠模型,观察胡芦巴碱对实验性2型糖尿病大鼠血糖、血脂、血清胰岛素水平及肝脏、骨骼肌中糖原含量的影响。2.采用Real-time PCR和Western blot方法,观察胡芦巴碱对实验性2型糖尿病大鼠海马中neuritin及MAPK各亚族信号通路表达的影响。初步探讨海马中neuritin表达及MAPK信号通路在胡芦巴碱抗2型糖尿病中的作用。实验方法1.2型糖尿病大鼠模型的建立SD大鼠50只,随机取6只作为正常对照组,正常喂养。其余44只采用高糖高脂饲料喂养2周后,禁食12h腹腔注射链脲菌素40mg·kg-1(用0.1mmol·L-1枸橼酸缓冲液(pH4.5)快速溶解并立即注射),正常对照组注射枸橼酸缓冲液。72h后取尾血测定空腹血糖,以空腹血糖≥16.7mmol·L-1为造模成功指标。共造模成功大鼠36只,剔除个别空腹血糖值异常的数据,挑选出糖尿病大鼠共30只。2.实验分组及给药将挑选出的30只糖尿病大鼠随机分为糖尿病模型组、胡芦巴碱低剂量组(5mg·kg-1)、胡芦巴碱中剂量组(15mg·kg-1)、胡芦巴碱高剂量组(45mg·kg-1)及阳性对照药罗格列酮组(4mg·kg-1)。连续灌胃给药8周,正常对照组和糖尿病模型组大鼠给予生理盐水灌胃,整个实验过程中无动物死亡。每两周测1次空腹血糖,每周称1次体重,根据体重调整给药量。3.取材及处理第8周末腹腔注射戊巴比妥钠(120mg·kg-1)麻醉禁食大鼠,取鼠尾血测定血糖值。仰卧式固定大鼠后开胸,采用10mL注射器从心尖取血,每只大鼠至少可取到10mL全血。大鼠采血后快速取脑组织,于冷PBS中分离海马；取肝脏和骨骼肌,液氮冻存。4.2型糖尿病大鼠血糖、血脂、血清胰岛素等血液指标的检测按照试剂盒说明书步骤,检测糖化血红蛋白、总胆固醇、甘油三酯及血清胰岛素的含量。计算胰岛素敏感指数：胰岛素敏感指数=ln[1/(空腹血糖水平×血清胰岛素含量)]5.肝脏和骨骼肌中糖原的检测参照试剂盒说明书,按样本重量加入相应比例碱液,沸水浴煮20min水解,将糖原水解液加相应蒸馏水制备成糖原检测液；葡萄糖标准液及显色剂现用现配；在空白管、标准管及测定管分别加入蒸馏水、标准液及检测液,再均加入等体积显色液,混匀后沸水煮5min,冷却后于620nm波长,1cm光径,测各管吸光度(A),计算糖原含量：糖原含量=(测定管A×标准管含量×样本测试前稀释倍数×10)/(标准管A×1.11)6.海马neuritin及MAPK各亚族信号通路基因和蛋白表达的测定分别采用Real-time PCR和Western blot实验技术,检测大鼠海马中neuritin、 ERK1/2、p-ERK1/2、JNK、p-JNK.p38MAPK、p-p38MAPK mRNA和蛋白的表达。7.统计方法所有数据以均数士标准差表示,应用SPSS13.0统计软件进行统计分析。多组间比较采用单因素方差分析,先进行方差齐性检验,方差齐选用LSD法,方差不齐采用校正的F检验(Welch法),并选用Dunnett’s T3做多重比较。以P<0.05为差异有显著意义。实验结果1.血糖和血脂水平与正常对照组比较,糖尿病模型组大鼠空腹血糖、糖化血红蛋白、总胆固醇和甘油三酯水平均显著升高(P<0.01)。给药4周末,胡芦巴碱中、高剂量和罗格列酮组大鼠空腹血糖水平均显著低于糖尿病模型组(P<0.01),并在随后4周里血糖值进一步降低,罗格列酮组空腹血糖值最低。胡芦巴碱中、高剂量组糖化血红蛋白、总胆固醇和甘油三酯水平显著低于糖尿病模型组(P<0.01)：罗格列酮组糖化血红蛋白水平亦显著下降(P<0.01),而总胆固醇和甘油三酯水平无显著变化(P>0.05)。胡芦巴碱低剂量组空腹血糖、糖化血红蛋白、总胆固醇和甘油三酯水平与糖尿病模型组比较无显著性差异(P>0.05)。2.血清胰岛素含量和胰岛素敏感指数与正常对照组比较,糖尿病模型组大鼠血清胰岛素含量显著升高,胰岛素敏感指数则显著降低(P<0.01)。与糖尿病模型组比较,中、高剂量胡芦巴碱和罗格列酮都能显著降低大鼠血清胰岛素水平,升高胰岛素敏感指数(P<0.01)。低剂量胡芦巴碱组大鼠血清胰岛素含量和胰岛素敏感指数与糖尿病模型组比较无显著性差异(P>0.05)。3.肝糖原和肌糖原含量与正常对照组比较,糖尿病模型组肝糖原和肌糖原含量显著降低(P<0.01)。与糖尿病模型组比较,胡芦巴碱中、高剂量和罗格列酮组肝糖原和肌糖原含量显著增加(P<0.01),恢复至接近正常对照组大鼠水平。低剂量胡芦巴碱未能提高糖尿病大鼠肝脏和骨骼肌中的糖原含量(P>0.05)。4.海马neuritin的表达与正常对照组比较,糖尿病模型组大鼠海马neuritin mRNA及蛋白的表达水平均显著下降(P<0.01)。与糖尿病模型组比较,胡芦巴碱低剂量组neuritin mRNA及蛋白的表达水平无显著差异(P>0.05)；胡芦巴碱中、高剂量组和罗格列酮组海马中neuritin mRNA和蛋白表达均显著升高(P<0.01)。5.海马MAPK各亚族信号通路的表达5.1海马ERK1/2的表达与正常对照组比较,糖尿病模型组大鼠海马ERK1/2蛋白的表达无显著性差异(P>0.05),而ERK1/2mRNA和p-ERKl/2蛋白的表达水平均显著升高(P<0.05)。与糖尿病模型组比较,胡芦巴碱低、中、高剂量组及罗格列酮组ERK1/2mRNA和ERK1/2、p-ERKl/2蛋白的表达水平均无显著性差异(P>0.05)。5.2海马JNK的表达与正常对照组比较,糖尿病模型组大鼠海马JNK mRNA和p-JNK1/2蛋白的表达水平均显著升高(P<0.01)。与糖尿病模型组比较,胡芦巴碱低剂量组JNK mRNA和p-JNK1/2蛋白的表达水平均无显著差异(P>0.05)；胡芦巴碱中、高剂量组和罗格列酮组海马中JNK mRNA和p-JNK1/2蛋白的表达均显著降低(P<0.01)。正常对照组、糖尿病模型组及各给药组大鼠海马中JNK1/2蛋白的表达无显著性差异(P>0.05)。5.3海马p38MAPK的表达与正常对照组比较,糖尿病模型组大鼠海马p38MAPK mRNA和p-p38MAPK蛋白的表达水平均显著升高(P<0.01)。与糖尿病模型组比较,胡芦巴碱低剂量组p38MAPK mRNA和p-p38MAPK蛋白的表达水平均无显著差异(P>0.05)；胡芦巴碱中、高剂量组和罗格列酮组海马中p38MAPK mRNA和p-p38MAPK蛋白的表达均显著降低(P<0.01)。正常对照组、糖尿病模型组及各给药组大鼠海马中p38MAPK蛋白的表达无显著性差异(P>0.05)。结论1.本研究利用小剂量腹腔注射链脲菌素加高糖高脂饲料喂养造模后,大鼠饮食、饮水及排尿量明显比正常对照组动物多,且空腹血糖、糖化血糖蛋白和血清胰岛素水平均升高,表明成功建立2型糖尿病模型,且模型大鼠总胆固醇和甘油三酯水平升高,存在糖脂代谢异常。2.2型糖尿病模型大鼠空腹血糖、糖化血糖蛋白、总胆固醇和甘油三酯水平较正常对照大鼠显著升高。中、高剂量胡芦巴碱和罗格列酮都能显著降低糖尿病模型大鼠空腹血糖和糖化血糖蛋白水平。同时,中、高剂量胡芦巴碱能降低糖尿病大鼠血清中总胆固醇和甘油三酯含量,使其恢复至接近正常水平。而低剂量胡芦巴碱和罗格列酮不能改善上述脂代谢指标。3.2型糖尿病模型大鼠血清胰岛素含量较正常对照大鼠显著升高,胰岛素敏感指数则显著降低。中、高剂量胡芦巴碱和罗格列酮均能显著降低糖尿病大鼠血清胰岛素水平,提高胰岛素敏感指数。4.2型糖尿病模型大鼠肝脏和骨骼肌中糖原含量较正常对照大鼠显著降低,表明与糖代谢密切相关的肝脏和骨骼肌中糖原贮存能力在糖尿病症状下受到损伤。经中、高剂量胡芦巴碱治疗8周后,糖尿病大鼠的肝糖原和肌糖原含量显著升高。5. Neuritin在成年大鼠海马中的表达较低,2型糖尿病模型大鼠海马中neuritin进一步减少,几乎检测不到蛋白表达。中、高剂量胡芦巴碱可促进糖尿病大鼠海马中neuritin的表达。同时也发现罗格列酮对糖尿病大鼠海马neuritin有上调作用。6.2型糖尿病模型大鼠海马中MAPK各亚族通路被激活,ERK1/2、JNK、 p38MAPK mRNA及p-ERK1/2、p-JNK1/2、p-p38MAPK蛋白表达均显著上调。中、高剂量胡芦巴碱下调糖尿病大鼠海马中升高了的JNK, p38MAPK mRNA及p-JNK1/2、p-p38MAPK蛋白表达水平,但不影响ERK1/2的表达。