DNA复制持续受到内源性或外源性复制压力的影响,包括DNA损伤、异常的二级结构、核苷酸的缺乏或转录过程的干扰。为了应对这些复制压力,细胞演化出了一套精密的复制压力应答反应来防止复制叉崩解并修复受损的DNA。复制叉翻转是一种常见的复制压力应答反应。复制压力解除后,翻转的复制叉能够被解旋,重新形成正常的复制叉结构,重启DNA复制。复制叉翻转-重启的过程受到精密的调控。复制叉翻转通过抑制DNA的合成、减少ss DNA的产生、促进模板切换机制介导不易错的DNA合成、防止复制叉崩解,从而使得细胞对抗复制压力。很多DNA代谢相关的酶参与复制叉翻转的过程,如DNA重组酶RAD51,转位酶HLTF、ZRANB3、SMARCAL1、RAD54和FANCM,解旋酶WRN、RECQL5、BLM和FBH1,但复制叉翻转的具体分子机制还不清楚。通过电镜观察DNA复制的中间结构来研究复制叉翻转的机制,我们发现在复制压力下,复制叉翻转是通过两步来完成的:1)复制叉的初始翻转;2)复制叉的深度翻转。我们发现TOP2A,ZATT和PICH的敲减会导致初始翻转的复制叉累积,而翻转复制叉总量减少。在复制压力下,TOP2A能够募集到停滞的复制叉上,而在RAD51,SMARCAL1,HLTF或ZRANB3敲减的细胞中,TOP2A不能有效地募集到停滞的复制叉上。这些结果表明RAD51,SMARCAL1,HLTF,ZRANB3介导复制叉翻转的起始,在新合成的DNA链上形成超螺旋的DNA结构,然后招募拓扑异构酶TOP2A。有意思的是,在复制压力下,ZATT能对TOP2A进行SUMO化修饰。PICH是一个SUMO靶向的转位酶,通过SIM结构域与被SUMO化修饰的TOP2A结合,组成ZATT-TOP2A-PICH复合物。ZATT-TOP2A-PICH复合物在RAD51,SMARCAL1,HLTF,和ZRANB3的下游发挥作用,促进复制叉的深度翻转。ZATT介导TOP2A的SUMO化修饰是复制叉深度翻转的起始信号,而SUMO靶向的泛素连接酶RNF4能够调节这种SUMO化修饰。我们发现在复制压力下,RNF4能募集到停滞的复制叉上,通过SIM结构域与被SUMO化修饰的TOP2A相互作用,并对其进行多聚泛素化修饰,使其通过蛋白酶体降解。相应的,RNF4的敲减会导致复制叉的过度翻转、复制压力解除后复制叉不能及时重启。这些结果说明RNF4抑制复制叉过度翻转,保证复制压力解除后复制叉能及时重启。根据以上的实验结果,我们提出了复制叉的翻转的两步模型:复制叉的初始翻转和复制叉的深度翻转。首先,重组酶RAD51与转位酶SMARCAL1、HLTF和ZRANB3协同起始复制叉翻转,在新合成的DNA链上形成超螺旋的DNA。然后由ZATT-TOP2A-PICH复合物促进复制叉的深度翻转。此外,我们还进一步证明RNF4通过对被SUMO化修饰的TOP2A进行多聚泛素化修饰使其降解,从而抑制复制叉的过度翻转,保证复制压力解除后复制叉能及时重新启动。我们提出的复制叉深度翻转的概念,进一步完善了复制压力应答反应的分子机制。