论文部分内容阅读
本研究的目的主要是在对单个卵裂球细胞进行多重置换扩增,获得大量优质模板DNA的基础上,建立对植入前胚胎进行多个基因位点或多种基因检测的方法,将其分别用于胚胎性别和HLA基因型的植入前遗传学诊断。首先我们通过显微操作的方式对植入前胚胎进行活检得到1-2个卵裂球细胞,分别采用蛋白酶K法(n=21)和碱法(n=17)对卵裂球细胞进行裂解,利用phi29 DNA聚合酶在多个位点30℃恒温条件下对单个卵裂球细胞进行了全基因组扩增,两种扩增方法的MDA扩增成功率未见统计学差异(85.7%vs.82.4%,P>0.05),单细胞组(n=15)和2个细胞组(n=23)之间MDA扩增成功率也未见统计学差异(80%vs.87.0%,P>0.05),显示多重置换扩增方法可以成功用于单个卵裂球细胞的全基因组扩增。在后续的植入前胚胎的基因检测中,我们收集1-2个卵裂球细胞,采用蛋白酶K法对细胞进行裂解,通过这种多重置换扩增的方法获得了足量优质的模板DNA用于后续基因检测。我们的研究分为两部分,第一部分为多重置换扩增结合荧光PCR进行植入前胚胎性别诊断。我们利用上面建立的植入前胚胎的单个卵裂球细胞多重置换扩增的方法对15个胚胎进行了扩增,有13个成功得到MDA扩增产物,扩增成功率86.7%。采用荧光PCR方法扩增SRY、XHPRT、AMEL和X22四个性染色体相关基因或STR位点,然后对扩增产物进行毛细管电泳,通过对电泳结果的分析来进行植入前胚胎的性染色体数目鉴定。13个胚胎中7个胚胎为男性,6个胚胎为女性,性别检测成功率100%；四个检测基因中,仅有一个胚胎的AMEL基因发生了等位基因脱扣,ADO发生率为7.7%,其他三个基因未发生ADO。因此,这种MDA结合荧光PCR是一种高效、准确率高的植入前诊断胚胎性别的方法,可以用于X连锁遗传病等的检测。本研究的第二部分为HLA基因型的植入前遗传学诊断。有4对夫妇自愿捐献外周血和废弃胚胎,被纳入本研究,获得6个废弃胚胎进行多重置换扩增,有5个成功得到MDA扩增产物,胚胎MDA扩增成功率为83.3%。我们采用PCR-SSP法检测其HLA-A、B、DR位点的多个等位基因,共有3个胚胎获得了HLA基因型检测结果,HLA基因型检测成功率为60%。成功获得HLA基因型检测结果的3个胚胎来自2个家庭,提取其父母外周血基因组DNA,同样采用PCR-SSP方法检测其HLA基因；通过父母与胚胎之间的比对,确定了两个家庭成员各自的HLA单倍型及其遗传关系,并在植入前胚胎之间进行了初步的HLA配型。该方法建立后,可以用于植入前胚胎HLA配型联合或不联合单基因遗传病的PGD检测,选择与患儿HLA吻合的胚胎移植,这样出生婴儿可以提供脐血或者骨髓治疗其患病同胞,为造血干细胞移植提供一种新的途径。