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前言 p16基因位于9p21染色体，是一种肿瘤抑制基因，特异地抑制周期素依赖激酶4／6（CDK4／6），阻止细胞进入增殖周期。p16在多种人类肿瘤细胞中均有缺失或突变，近两年的研究更发现5′CpG岛的高度甲基化是其在血液系统恶性疾病尤其是白血病中的另一种失活方式，而且发生率也比较高。甲基化特异性聚合酶链反应（Methylation-specific PCR，MSP）方法，为基因CpG岛甲基化研究提供了有效的方法。p16的甲基化异常是血液系统恶性疾病基因水平研究的新课题，本实验目的是在验证p16甲基化与白血病关系的基础上，进一步探讨其与其他恶性血液病如淋巴瘤、骨髓增生异常综合征、浆细胞病等的关系，从临床角度探讨恶性血液病与p16基因甲基化的关系，为更深层次的研究及临床的实际应用奠定基础。 材料与方法 研究对象为急性白血病40例，慢粒白血病5例，非霍奇金淋巴瘤13例，骨髓增生异常综合征11例，多发性骨髓瘤7例。标本取自患者的外周血，12名正常对照为健康自愿献血者。外周血按照常规的蛋白酶k消化，苯酚-氯仿-异戊醇抽提，无水乙醇沉淀的方法提取DNA。将DNA用NaHSO3处理：取DNA2.5μl溶于12.5μl水中，加入0.4mmol／L NaOH12.5μl，37℃10分钟；再加入10mmol／L C6H6O215μl及3mol／L PH5的NaHSO3260μl，液体石蜡覆盖（隔离空气），在50℃孵育16小时反应后冷冻除去液体石蜡。加人smM NaAc 4℃4 ／J’时对．smM C。H。O。4℃ 4 ／J＼日，0．SM NaAc4℃过夜，用蒸馏水 4℃4小时洗两次，溶于 50 pl水中 4℃过夜。加人等体积的0．6moUL NaOH，室温5分钟，再加人等体积6moVLNH冲c及2倍体积预冷的无水乙醇，－20℃过夜，12000r／min离心 10分钟，得DNA沉淀，加人体积分数为70％的冷乙醇上2000r／dn离心10分钟，洗2次，弃上清，得DNA沉淀，吹干，30…去离子水溶解 DNA，－20℃保存待做 PCR。PCR反应体系为 50 pl，含10 x缓冲液（16．6mM硫酸铰／67mM Tis，PH 8．8／6．7mM MgCI。／10mM 2一流基乙醇），dNTWirl，弓物 0．sul，NaHSO。处理的＊＊＊4…，＊＊A聚合酶0．2卜1。扩增条件：96℃预变性5分钟，95℃30秒，60℃30秒，72℃30秒，进行35个循环，最后一个循环72℃延伸7分钟。每次扩增均设对照。将MSP产物与上样液按6：1混合，于8％聚丙烯酸胺凝胶上电泳，紫外分析仪下观察，拍照。 实 验 结 果 初治或复发的急性白血病患者MSP阳性率为64刀％(37例中 24例为阳性人其中急性非淋巴细胞白血病为 59．l％(22例中 13例为阳性人急性淋巴细胞白血病为 73．3％(15例中 11例为阳性厂两型间差异无显著性（P＞0．05，X‘＝0．29人 3例完全缓解期的急性白血病p例AML，1例ALL）为阴性。5例慢粒白血病患者均表现为阴性，其中4例处于慢性期，互例处于急变期。非霍奇金淋巴瘤阳性率为53．8％（13例中7例阳性人骨髓增生异常综合征和多发性骨髓瘤为阴性。 讨 论 P16通过与细胞周期素DIk）竞争性结合CDK4历，抑 ·2·制CDK4历的活性，从而抑制细胞的增殖。P16基因常通过缺失而在包括白血病在内的多种人类肿瘤中失活，近年的研究发现，位于 P16基因转录起始区的 CPC；岛高度甲基化是使该基因失活的另一主要方式。Herman等总结出甲基化特异性聚合酶链反应即MSP方法，其原理是：对DNA进行硫化处理后DNA中的胞喷院C转变为尿峻院U，而基因若已发生CPG岛甲基化K一甲基胞嘴陡M不会发生这种转化仍保持为胞喷喷C，使用能够鉴别甲基化与非甲基化的不同引物做PCR即可检测出这种差别，从而确定目的基因有无 CpG岛甲基化。由于设计了甲基化引物 M和非甲基化引物U，h者中至少有一个有扩增，否则即表明MSP失败，这样就无须设定内对照。本实验中采用MSP方法对几种不同类型的恶性血液病的P16 CPG岛甲基化异常进行了研究，结果显示：急性白血病P16 CPG岛甲基化阳性率为64．9％D7例中有24例太急非淋和急淋二型之间阳性率无显著差异；慢粒白血病无甲基化发生，无论是在慢性期还是急变期(例数尚少，且缺乏加速期的样本，需要进一步观察人非霍奇金淋巴瘤P16 CPG岛甲基化阳性率为 53．8％(13例中 7例阳性尸骨髓增生异常综合征和多发性骨髓瘤为阴性；正常人为阴性。与已有的相关研究相比，如果在本实验中同时检测… 基因缺失情况，P16基因的失活率可能会更高。 综上所述，P16的甲基化异常是血液系统恶性疾病基因水平研究的新课题，进一步的研究对其发病机埋、微小残留病变的检测以及新的治疗方法的探索等均有很大意义。 结 论 初治或复发的急性白血．病P16 CPG岛甲基化阳性率为64．9％急非淋和急淋二型之间阳性率无显著差异；3例完全缓解的急性白血病为阴性；慢粒白血病无甲基化发生；非霍奇金淋巴瘤 ·3·p16 CpG岛甲基化阳性率为53．8％；骨髓增生异?