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在本室前期工作中,通过抑制差减杂交,建立了紫云英结瘤固氮过程中的差异表达cDNA文库,本研究将其下调表达cDNA文库进行了全文库测序,共获得180个有效序列,cDNA克隆插入片段在200-1,300 bp之间。将所有序列进行了同源比较,比对条件为匹配区域长度＞100 bp且相似度＞75%。符合要求的共有94个,发现其中4个在数据库中找不到其同源片段,可能代表4个新的基因。将符合条件的基因按分子功能分类,分为10个类群:核糖体蛋白11个,信号转导相关11个,基因表达相关13个,代谢相关22个,膜及转运相关13个,应激防御相关9个,未知蛋白6个,假定蛋白4个,无同源片段4个和其他1个。根据测序分析结果,对其中的6个基因进行了半定量RT-PCR验证分析,结果表明:它们在根瘤中表达水平均比未接种根中要低。运用RACE（rapid-amplification ofcDNA ends）法获得了其中2个基因（AsA8和AsD5）的全长cDNA和编码区。序列分析表明:AsA8编码的多肽含379个氨基酸,分子量为42 kDa,等电点为5.78。与豌豆中的12-氧代植二烯酸-10,11-还原酶同源性较高,不含信号肽。AsD5编码191个氨基酸的多肽,含有一个22个氨基酸的信号肽,信号肽可以被切除,成熟的多肽分子量为19 kDa,等电点为8.78。与拟南芥质体蓝素相似。另外4个基因:AsB3编码的蛋白与拟南芥C3HC4型锌指家族蛋白相似,AsG6编码的蛋白与拟南芥过氧化物酶相似,AsT6编码的蛋白与杨毛果预测蛋白相似,AsC2编码的蛋白与热休克蛋白（heat shock proteins,HSPs）相似。进一步通过实时荧光定量PCR,研究了AsA8和AsD5的时空和组织表达特征。结果显示:从不同植物器官中基因的表达情况来看,AsA8和AsD5在根瘤中的表达水平都较未接种根中低,均在紫云英根瘤中呈下调表达特征。AsA8在植物茎中几乎不表达,根瘤和叶片中的表达差异不大,去瘤根中的表达量最高。AsD5则在所有检测组织中均有表达,根瘤、茎和叶中表达相当,去瘤根中表达量最高。从接种后不同时段的基因的表达情况来看,AsA8在成熟根中的转录水平远高于幼根,主要在21-25 d表达。相反,AsD5在成熟根中的转录水平远低于幼根。接种后6d,可以检测到一个较高的表达量,随后一直到接种后30d,其表达量都很低（P＜0.05）。由此推测,AsA8主要在成熟根中参与茉莉酸的合成,调控根瘤菌的侵染和根瘤形成,而AsD5主要在接种早期幼根中发挥生理功能,具体作用尚不明确。以上实验结果为进一步通过超表达深入研究目标（下调表达）基因在紫云英结瘤固氮过程中的功能打下了良好工作基础。