【摘 要】
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目的:研究铃蟾肽（Bombesin,BN）致小鼠瘙痒的作用特点,并探究其致瘙痒的中枢调控机制。方法:（1）予KM小鼠侧脑室注射BN后观察小鼠瘙痒的相关行为:梳理行为,抓挠行为,舔身体行为;（2）分别侧脑室注射（i.c.v）BN（0.04μg,0.4μg,4μg）及尾静脉注射BN后,观察和比较对BN诱发抓挠行为的影响;（3）观察皮下注射5μg/kg或50μg/kg抗瘙痒药物纳呋拉菲（nalfuraf
【基金项目】
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国防科技卓越青年科学基金（2018-JCJQ-ZQ-017 2018-2021）；
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目的:研究铃蟾肽（Bombesin,BN）致小鼠瘙痒的作用特点,并探究其致瘙痒的中枢调控机制。方法:（1）予KM小鼠侧脑室注射BN后观察小鼠瘙痒的相关行为:梳理行为,抓挠行为,舔身体行为;（2）分别侧脑室注射（i.c.v）BN（0.04μg,0.4μg,4μg）及尾静脉注射BN后,观察和比较对BN诱发抓挠行为的影响;（3）观察皮下注射5μg/kg或50μg/kg抗瘙痒药物纳呋拉菲（nalfurafine,Nal）预处理后对瘙痒介质BN、组胺、氯喹诱发小鼠抓挠行为的影响;（4）构建耦联荧光标签NBD（7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazole）的BN（NBD-BN）,示踪瘙痒发生期间NBD-BN（i.c.v）在脑内的动力学分布,确定BN分布的靶区域;（5）免疫组化和蛋白质免疫印迹（Western blotting,WB）用于分析BN受体神经介素B受体（Neuromedin B receptor,NMBR）和胃泌素释放肽受体（Gastric-releasing peptide receptor,GRPR）的表达情况;（6）免疫荧光和WB用于检测BN（i.c.v）处理后脑内c-fos蛋白表达情况;（7）比较下丘脑原位注射和侧脑室注射BN诱发抓挠行为的影响;（8）通过RNA-seq筛选并用WB验证参与BN生物学效应的信号通路。（9）比较预处理NMBR拮抗剂PD168368、GRPR拮抗剂RC3095、PKA拮抗剂Rp-cAMPS对BN诱发小鼠抓挠行为的影响。结果:（1）小鼠经BN（i.c.v）处理主要诱发抓挠行为,30min观察期内0.04μg BN诱发抓挠行为占其总行为次数的73.21%,0.4μg BN占比66.07%,4μg BN占比66.07%;（2）BN i.c.v（0.04μg,0.4μg,4μg）诱发明显抓挠行为,与Veh组相比,0.04μg（p＜0.05）,0.4μg（p＜0.01）,4μg（p＜0.001）BN诱发抓挠行为次数均显著增加,BN（0.4μg,4μg,400μg）（i.v）未观察到小鼠产生明显抓挠行为;（3）经nalfurafine（5μg/kg,50μg/kg）预处理后,与Veh相比,组胺（p＜0.001,p＜0.001）和氯喹（p＜0.001,p＜0.001）诱发scratching显著下降,BN诱发的抓挠行为无显著性差异;（4）荧光示踪结果显示:在5,10,20,30min均能观察到NBD-BN在下丘脑分布,10min时荧光强度达到峰值（p＜0.01）;（5）免疫组化和WB均显示下丘脑有BN受体GRPR和NMBR的分布;（6）WB结果显示:与Veh组相比,BN（i.c.v）处理后下丘脑c-fos蛋白表达显著增加（p＜0.01）。免疫荧光结果显示:下丘脑c-fos蛋白表达增加且在下丘脑背内侧核分布较多。（7）BN i.c.v和i.s.i诱发的抓挠行为次数无显著差异。与i.c.v相比,BN i.s.i的瘙痒潜伏期显著降低（p＜0.01）;（8）RNA-seq结果表明c AMP相关的PKA/CREB信号通路参与BN介导的生物学效应,WB结果显示,与Veh相比,BN i.c.v组下丘脑PKA在10 min（p＜0.05）和20min时（p＜0.01）显著上调,30min时下丘脑CREB磷酸化水平显著上调（p＜0.05）;（9）与Veh组相比,PD168368（0.15-1.5μg）及RC3095（0.01–1μg）预处理后,BN诱发的抓挠行为次数无显著性差异。与Veh相比,0.02μg Rp-cAMPS（p＜0.01）与0.2μg Rp-cAMPS（p＜0.001）预处理后,BN诱发的抓挠行为次数显著下调。结论:BN i.c.v可诱发小鼠瘙痒产生强烈的抓挠行为行为且源于中枢为一种全身性瘙痒,无注射侧偏好性。BN与组胺和氯喹诱发的抓挠行为中枢机制不同。BN i.c.v处理后,下丘脑BN受体分布的区域c-fos蛋白表达上调,发现c AMP/PKA/CREB信号通路响应与BN介导的生物学效应相关联,提示下丘脑PKA/CREB信号通路参与调控BN介导的瘙痒效应。
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