【摘 要】
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目的:创建遗传稳定、表型明确的自发色素异常综合征型耳聋豪猪模型家系,准确鉴定其致病基因及其突变位点,以期为研究相应的人类遗传性耳聋的分子致病机制提供理论依据和参考。方法:1.创建自发色素异常综合征型耳聋豪猪模型家系并验证其遗传模式:将前期发现和获得的具有相同表型特征的4头自发色素异常综合征型耳聋突变雄性豪猪与野生型雌性豪猪配种传代并扩群繁殖,建立能稳定遗传的遗传性耳聋疾病模型家系,检测并比较所有后
【基金项目】
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国家自然科学基金（81660176）；
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目的:创建遗传稳定、表型明确的自发色素异常综合征型耳聋豪猪模型家系,准确鉴定其致病基因及其突变位点,以期为研究相应的人类遗传性耳聋的分子致病机制提供理论依据和参考。方法:1.创建自发色素异常综合征型耳聋豪猪模型家系并验证其遗传模式:将前期发现和获得的具有相同表型特征的4头自发色素异常综合征型耳聋突变雄性豪猪与野生型雌性豪猪配种传代并扩群繁殖,建立能稳定遗传的遗传性耳聋疾病模型家系,检测并比较所有后代中突变型个体与野生型个体明显的外观表型特征与数量比例,作卡方检验以确认突变表型的遗传模式。2.自发色素异常综合征型耳聋模型豪猪的病理检查及听功能鉴定:首先作详细的大体外观检查,将皮肤、毛发（含棘刺）及眼视网膜具有色素沉着异常的个体判定为突变型,同时检查突变型个体是否存在小眼畸形表型;进一步采集突变型个体和野生型个体的皮肤和耳蜗组织进行病理形态学观察;最后采用脑干诱发电位（ABR）法进行听功能的检查和鉴定。3.致病基因及突变位点的精细定位:采用混合分离分析（BSA）法筛选自发色素异常综合征型耳聋模型豪猪的SNP和In Del位点;采集野生型豪猪皮肤组织样本进行无参转录组测序,注释并提取候选基因转录本序列;采用生物信息学方法对候选基因进行注释;根据筛选的候选基因中的SNP或In Del位点设计引物,PCR扩增候选基因突变位点所在序列并进行Sanger测序验证。结果:1.成功创建自发色素异常综合征型耳聋豪猪模型家系:4头F0代雄性突变豪猪（显性杂合子）经扩群繁殖共获得F1代38头,其中突变个体（显性杂合子）21头,野生型个体17头,突变型性状与野生型性状的分离比为1.24,经遗传学卡方检验明确其遗传模式符合常染色体显性遗传。以F1代显性杂合子互交,目前只在F2代中获得2头显性纯合子突变个体。2.表型鉴定结果:自发色素异常综合征型耳聋突变豪猪杂合子个体的皮肤和毛发（含棘刺）存在不同程度的色素沉着异常,眼视网膜浅染,纯合子突变个体的皮肤和毛发完全无色素沉着（完全白化）,同时表现出眼球发育畸形（小眼畸形）;突变型豪猪的耳蜗血管纹结构松散塌陷,内部毛细血管减少,与临近组织界限不清;ABR听功能检查发现,野生型豪猪可以全频（0.5 k Hz,1 k Hz,4 k Hz,8 k Hz,16 k Hz和32 k Hz）引出可辨别的且可以重复的ABR波形,而突变型豪猪在最大声压级120 d B也无法引出可辨别的、可重复的ABR波形,表明突变型豪猪患有严重的感音神经性耳聋。3.致病基因及突变位点的精细定位结果:通过BSA法,共得到30931439个SNP位点和3357842个In Del位点,以野生型池减去突变型池中的SNP-index和In Del-index来计算ΔSNP-index和ΔIn Del-index,再进行置换检验,达到置信水平99%的SNP和In Del位点共545个;对野生型豪猪皮肤组织进行无参转录组测序,共得到约6 Gp的原始数据,注释得到豪猪Mitf基因转录本序列4条（Gene Bank登录号分别为:MW840376、MW840377、MW840378和MW840379）,将得到的转录本序列与人的MITF基因转录本进行Blast比对,进一步注释豪猪Mitf的外显子区域;将BSA法筛选得到的豪猪Mitf基因序列的SNP及In Del位点根据该基因的注释结果进行定位,得到一个有义突变位点为Mitf c.875＿877del AGA（Arg217del）,根据该位点设计引物进行PCR扩增并进行Sanger测序验证,结果表明该突变位点与豪猪突变表型性状共分离。结论:本研究成功创建了遗传模式为常染色体显性遗传的自发色素异常综合征型耳聋豪猪模型家系;表型鉴定表明该模型的表型特征与人类Waardenburg综合征2型的疾病表现十分相似;同时,本研究准确鉴定了自发色素异常综合征型耳聋模型豪猪的致病基因及突变位点为Mitf c.875＿877del AGA（Arg217del）。研究结果可为研究相应的人类遗传性耳聋疾病的分子致病机制提供理论依据和参考。
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