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1.目的原发性肝癌是我国最常见的恶性肿瘤之一,年死亡率占全部恶性肿瘤的18.8%。诊断明确的肝癌患者生存期通常少于1年,肿瘤转移和复发是肝癌患者的主要死因。为提高肝癌患者的生存率,早期诊断及早期治疗具有重要意义。血清蛋白质组分析(serological proteome analysis,SERPA)技术是蛋白质组学与免疫学结合产生的一种高通量筛选、鉴别肿瘤抗原及其抗体的新技术。其原理是利用双向电泳分离肿瘤组织或细胞的总蛋白后将其转膜,再与肿瘤患者的血清免疫印迹,通过质谱鉴定双向凝胶上对应的反应点来确定肿瘤自发抗原及抗体。本研究应用SERPA联合蛋白芯片技术,以人肝癌细胞系HepG2和HepG2.2.15总蛋白作为抗原来筛选肝癌诊断标志物,最终实现通过多标志物组合检测达到肝癌早期诊断的目的,为肝癌进一步的免疫诊断及治疗奠定基础。2.方法2.1血清蛋白质组分析提取HepG2细胞总蛋白,按Amersham公司双向电泳手册和Gorg等方法进行双向电泳,获得3张相同的凝胶,其中一块2-DE凝胶经胶体蓝染色作为平行胶,其余两块2-DE凝胶经电转印将凝胶中的蛋白质转移至PVDF膜,然后分别与肝癌患者的血清及正常对照血清进行western blot,获得western印迹反应图谱。提取HepG2.2.15细胞蛋白,按上述同样方法,获得胶体蓝染色的2-DE凝胶图谱及与HBsAg(+)的肝癌血清、HBsAg(-)的肝癌血清、正常血清反应的western印迹图谱。经计算机图像分析识别差异反应的蛋白(即与肝癌血清反应阳性而与正常血清反应阴性的点),然后在平行的2-DE凝胶上找到与western blot中差异反应蛋白质点相匹配的蛋白质点,再对这些差异蛋白进行胰酶酶切及MALDI-TOF质谱鉴定。2.2重组蛋白的表达与纯化分别提取提取HepG2和HepG2.2.15细胞的总RNA,按照反转录盒提供的说明书合成cDNA。设计及合成SERPA中鉴定出的各蛋白的引物,以cDNA作模板,在常规PCR仪上进行PCR扩增。PCR产物采用promega公司的纯化试剂盒进行纯化。将纯化的PCR产物与相应表达载体连接,然后采用原核系统进行表达,并对表达的蛋白进行纯化和定量。2.3蛋白芯片的制备将纯化得到的蛋白溶于点样液(含0.02%SDS,1%glycerol的PBS),使其终浓度为0.5ug/ul,用点样仪按一定排列矩阵喷点于醛基化玻片,制备蛋白芯片。将芯片先后与待检测的血清(包括肝癌血清、肝炎血清、其他肿瘤血清和正常对照血清)及Cy3荧光标记的鼠抗人IgG进行杂交反应。杂交后芯片用GenePix4000扫描仪扫描成像,获得图像用仪器自带分析软件GenePixPr04.0分析。3.结果3.1肝癌相关抗原及自身抗体的筛选与鉴定提取HepG2和HepG2.2.15细胞总蛋白后进行双向电泳及转印至PVDF膜。以HepG2细胞总蛋白为抗原,分别与8例正常血清及8例肝癌患者血清进行免疫印迹。以HepG2.2.15细胞总蛋白为抗原,分别与10例正常血清、10例HBsAg(+)的肝癌血清及10例HBsAg(-)的肝癌血清进行免疫印迹。western blot结果与双向电泳参考胶及转膜后考马斯亮蓝染色的PVDF膜进行匹配,在HepG2和HepG2.2.15平行胶分别筛选出6个和10个相应的差异反应蛋白点(只与肝癌患者血清反应而不与正常血清反应的蛋白质点)。通过质谱鉴定和查询数据库,6个HepG2蛋白点分别鉴定为keratin 8、lamin A/C、DEAD box polypeptide 3和真核翻译延伸因子2(eukaryotic translationelongation factor 2,eEF2)。10个HepG2.2.15蛋白点中,programmed cell death8(apoptosis-inducing factor,AIF)、hnRNP A2、cyclophilin A、谷草转氨酶1(aspartate aminotransferase 1)蛋白与HBsAg(+)及HBsAg(-)的肝癌患者血清皆反应而不与正常血清反应。磷酸丙糖异构酶(triosephosphate isomerase,TIM)、prostatic binding protein仅与HBsAg(-)肝癌患者血清反应而不与HBsAg(+)的肝癌患者血清及正常血清反应。丙酮酸激酶(pyruvate kinase)、磷酸甘油酸激酶1(phosphoglycerate kinase 1)、磷酸甘油变位酶1(phosphoglycerate mutase 1)仅与HBsAg(+)肝癌患者血清反应而不与HBsAg(-)的肝癌患者血清及正常血清反应。3.2利用western blot技术筛选特异抗原我们从鉴定出的13个蛋白中选择了8个进行重组蛋白的制备。利用pGEX-4T-1载体构建重组质粒及表达kertain 8蛋白,分别利用pET28a(+)载体构建重组质粒及表达lamin A/C、eEF2及prostatic binding protein蛋白,分别利用pET43.1a(+)载体构建重组质粒及表达DEAD box polypeptide 3、hnRNPA2及AIF蛋白。表达出的蛋白根据其所携带的标签采用Glutathione Sepharose4B柱或镍亲和层析柱进行纯化。TIM蛋白购于Sigma公司。利用这8个蛋白作抗原,28例肝癌患者血清及10例正常对照血清作为一抗,westem blot分析结果显示各蛋白相应抗体在肝癌血清中的阳性率从21.4%至71.4%,而正常血清中阳性率从0至20%。3.3利用蛋白芯片技术筛选特异抗原将纯化蛋白按一定排列顺序喷点于修饰玻片制成蛋白芯片。将采集到的血清标本用样品稀释液1:10稀释后与芯片杂交,扫描仪扫描获得图像,用仪器自带分析软件分析各蛋白的荧光信号强度,并判断样品的阴阳性。应用制备的芯片共检测了118份肝癌患者血清、63份慢性肝炎患者血清、66份其它肿瘤患者血清及43份健康正常人的血清。分析结果显示keratin 8和laminA/C的特异性差,在肝炎组及正常组中阳性频率很高,这2个蛋白可能不是肝癌特异性抗原,因此我们在接下去的分析中排除了上述2个蛋白。在肝癌组中,其余6个蛋白的相应抗体阳性率均显著高于正常组(P＜0.001)及肝炎组(P＜0.05)。DEAD box、AIF、prostatic binding protein相应自身抗体的阳性率明显高于其它肿瘤组(P＜0.05)。我们同时检测了血清AFP水平,其诊断肝癌的敏感性和特异性分别为80.5%和70%,但AFP的阳性率在肝癌组与肝炎组中没有明显差别。诊断TNMⅠ期肝癌时,DEAD box polypeptide 3、eEF2、AIF、hnRNP A2、prostatic binding protein及TIM的敏感性分别是85%、75%、60%、70%、50%和60%,特异性分别是69.8%、78.5%、81.4%、70.9%、82.6%和75%,联合上述6个抗体并以其中任何1个阳性即判断为阳性,敏感性上升为90%。对肝癌临床病理参数与抗体阳性率相互关系的分析结果显示患者性别、组织学分级、TNM分期与各抗体的阳性率均无明显相关性。当肿瘤直径大于5cm时,抗eEF2阳性率明显升高。在局部淋巴结转移的肝癌患者中,抗AIF及hnRNP A2的阳性率明显低于无淋巴结转移的患者。4.结论SERPA是一种高通量筛选、鉴定肿瘤自发抗体的新技术,可以对肝癌自身抗体进行系统的分析,能有效地、全面地筛选肝癌标志物。DEAD boxpolypeptide 3、eEF2、programmed cell death 8、hnRNP A2、prostatic bindingprotein、TIM相应的自身抗体的检测,不仅能为肝癌早期诊断提供分子标志物,而且有助于揭示肝癌发病的分子机理,具有重要的理论意义和应用前景。