糖尿病(DiabetesMellitus，DM)具有高致死率、高致残率和高医疗花费等三大特征。其中的高致残率主要包括糖尿病视网膜病变(diabeticretinopathy，DR)。DR的发生发展不但与血浆葡萄糖水平相关，还与患病时间密切相关。越来越多的研究证实，在糖尿病早期，视网膜就存在着两种特征性的病理改变：血-视网膜屏障破坏和神经细胞凋亡。两者共同演绎着DR早期的演变。 作为一种强力的血管渗漏因子，血管内皮细胞生长因子(vascularendothelialgrowthfactor，VEGF)在糖尿病视网膜血管病变中起着关键的作用，它介导着糖尿病早期血-视网膜屏障(Blood-RetinalBarrier)的破坏。 Caspase依赖性和Caspase非依赖性凋亡途径是各种原因所致的神经细胞凋亡的两种基本途径。糖尿病介导的视网膜神经细胞凋亡途径也应该如此。但目前大多数DR神经细胞凋亡的研究集中在Caspase依赖性凋亡途径上，而对Caspase非依赖性凋亡途径的研究甚少。如果能够明确哪种凋亡途径在糖尿病早期视网膜神经细胞的凋亡中占主导作用，将有助于视网膜早期更有效的神经保护。 氧化应激(oxidativestress，OS)与糖尿病及其并发症的发生、发展密切相关。抗氧化剂治疗糖尿病及其并发症是目前研究的热点。中草药是具有很大潜力的天然抗氧化剂资源。在中草药的抗氧化成分中，黄酮类因具有纯天然、活性高等特点而备受关注。槲皮素是黄酮类中分布最广、抗氧化能力最强的一种天然药物。 丝裂素活化蛋白激酶通路(mitogen-activatedproteinkinase，MAPK)作为氧化应激的下游目标，具有将氧化应激信号从细胞外传递到细胞内的作用。在高糖环境的体外实验研究中，P38MAPK活性增强能够诱导视网膜内皮细胞和神经细胞的功能障碍。如果在糖尿病早期的体内实验中，存在氧化应激诱导的P38MAPK信号通路调控视网膜病变，那么局部的抗氧化剂治疗也许能够对糖尿病早期血.视网膜屏障和神经细胞起着保护作用。本课题将对上述问题分三个部分展开实验研究。 第一部分糖尿病鼠早期VEGF介导的血-视网膜屏障破坏和easpase依赖的视网膜神经细胞凋亡的实验研究 目的：观察糖尿病鼠早期血-视网膜屏障破坏和视网膜神经节细胞凋亡的方式；探讨糖尿病早期视网膜神经节细胞凋亡的途径。 方法： 制作链脲佐菌素(Streptozotocin，STZ)诱导的糖尿病雄性Wistar大鼠。1、应用IgG血管外渗漏评估BRB功能的破坏；2、采用TUNEL法、Caspase-3和凋亡诱导因子(apoptosis-inducingfactor,AIF)免疫荧光染色法定量视网膜节细胞的凋亡；3、利用RT-PCR、Westernblot和免疫组化等技术检测视网膜上VEGF、Caspase-3和AIF的基因、蛋白表达和分布；4、通过玻璃体腔注射2μL(4μg)的Caspase-3抑制剂DEVD-CHO，进一步明确糖尿病鼠早期视网膜神经节细胞凋亡的途径。实验数据采用均数±标准差表示，P<0.05为统计学显著性差异判定标准。 结果： 糖尿病鼠2周，视网膜出现以IgG血管外渗漏为示踪物的BRB破坏，4周最为明显，8周开始有所减轻，但均明显强于年龄匹配的正常对照组(P<0.01)。VEGF基因和蛋白的表达以及在视网膜神经纤维层、节细胞层和内丛状层的分布也在糖尿病2周开始出现异常。其中基因表达2周出现高峰，蛋白和荧光表达4周最明显，8周开始减轻。虽然视网膜内、外核层厚度和年龄匹配的正常对照组无明显的差异(P>0.05)，但是视网膜节细胞的凋亡在2、4、8周均有明显增加(P<0.01)。另外，Caspase-3基因和蛋白的表达以及在视网膜神经纤维层、节细胞层和内丛状层的分布在糖尿病2周开始出现异常。其中基因表达2周出现高峰，蛋白和荧光表达4周最明显，8周开始有所减轻，但仍高于正常对照组(P<0.05)。AIF基因表达在观察时间内没有检测到。CaspaSe-3抑制剂DEVD-CHO的玻璃体腔注药通过抑制Caspase-3的表达而降低了视网膜节细胞的凋亡。 结论： STZ诱导的糖尿病Wister大鼠早期，出现了VEGF介导的血-视网膜屏障破坏和视网膜神经节细胞凋亡。其中节细胞凋亡是以Caspases依赖性凋亡途径为主。糖尿病早期视网膜的病变可能是一种应激过程。 第二部分糖尿病鼠早期氧化应激诱导P38MAPK信号通路调控血-视网膜屏障破坏和视网膜神经细胞凋亡的作用机制 目的：探讨氧化应激导致糖尿病早期血-视网膜屏障破坏和视网膜神经节细胞凋亡的途径及其发生机制。 方法： 制作STZ诱导的糖尿病雄性Wistar大鼠。1、通过检测视网膜组织中脂质过氧化物(lipidperoxidation，LPO)和还原型谷胱甘肽(Glutathioneperoxidase，GSH)的蛋白含量，了解糖尿病早期氧化应激在视网膜病变中的作用；2、利用RT-PCR和Westernblot技术检测视网膜上P38MAPK的表达；3、玻璃体腔注射2μL(3.77μg)的P38MAPK抑制剂SB2035802周和6周后，以IgG血管外渗漏为示踪物的BRB功能破坏和Caspase-3介导的视网膜节细胞凋亡的改变，明确P38MAPK诱导糖尿病早期视网膜病变的发生机制。实验数据均采用均数±标准差表示，P<0.05为统计学显著性差异判定标准。 结果： 从糖尿病鼠2周开始，视网膜组织中LPO蛋白含量显著升高(P<0.01)，GSH蛋白含量明显下降(P<0.01)。活性P38MAPK基因和蛋白的表达在糖尿病2周开始表达增强，4周表达最明显，8周有所减弱，但均明显强于年龄匹配的正常对照组(P<0.01)。P38MAPK抑制剂SB203580玻璃体腔注药2周和6周后，视网膜上VEGF和Caspase-3的免疫荧光表达均明显减弱(P<0.01)。以IgG血管外渗漏为示踪物的BRB破坏均显著减轻(P<0.01)，TUNEL-阳性和Caspase-3阳性视网膜节细胞凋亡率均明显下降(P<0.01)。 结论： 糖尿病鼠早期存在着氧化应激对视网膜的毒性作用，氧化应激通过诱导下游信号系统P38MAPK通路的激活，导致了糖尿病早期视网膜BRB的破坏和神经节细胞的凋亡。 第三部分槲皮素抑制糖尿病鼠早期氧化应激诱导的血-视网膜屏障破坏和视网膜神经细胞凋亡的实验研究 目的：探讨槲皮素玻璃体腔给药途径的可行性；明确槲皮素对氧化应激诱导的糖尿病早期血-视网膜屏障破坏和视网膜节细胞凋亡的保护作用。 方法： 制作STZ诱导的糖尿病雄性Wistar大鼠。1、通过对糖尿病4周大鼠玻璃体腔分别注射剂量为0.02nM、0.2nM、2nM和10nM的槲皮素2μL，检验不同剂量的槲皮素对视网膜的毒性作用，确定对视网膜起保护作用的最佳剂量；2、检测槲皮素玻璃体腔注药后，视网膜组织中LPO和GSH的蛋白含量，了解槲皮素在视网膜中的抗氧化作用；3、分别检测槲皮素玻璃体腔注药2周和6周后，活性P38MAPK蛋白量的变化、视网膜石蜡切片HE染色形态学的变化、以IgG血管外渗漏为示踪物的BRB功能破坏的变化、视网膜上VEGF和Caspase-3免疫荧光表达的变化，以及视网膜节细胞凋亡的改变等，明确槲皮素对糖尿病早期血-视网膜屏障破坏和视网膜节细胞凋亡的保护作用。实验数据均采用均数±标准差表示，P<0.05为统计学显著性差异判定标准。 结果： 玻璃体腔注射剂量为2nM的槲皮素，对糖尿病早期视网膜病变的抑制作用最强(P<0.01)，玻璃体腔注射10nM的槲皮素，出现视网膜内、外核层细胞核减少、视网膜水肿以及节细胞凋亡增加等毒副作用。玻璃体腔注射2nM槲皮素治疗2周和6周后，视网膜组织中LPO蛋白含量均显著降低(P<0.01)，GSH蛋白含量均明显升高(P<0.01)；活性P38MAPK蛋白表达量均明显下降(P<0.01)。同时发现，视网膜节细胞层VEGF和Caspase-3免疫荧光表达明显减弱(P<0.01)，IgG血管外渗漏为标志的BRB破坏明显好转(P<0.01)，TUNEL-阳性视网膜节细胞凋亡率明显下降(P<0.01)。 结论： 玻璃体腔注射槲皮素治疗糖尿病早期视网膜病变切实、可行。槲皮素能够减轻糖尿病早期视网膜BRB的破坏，抑制节细胞的凋亡。槲皮素对糖尿病视网膜的保护是通过抗氧化作用机制来实现的。