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肝细胞癌是世界上多发的肿瘤之一,在中国及东南亚地区尤为多见,其死亡率高且预后差。肝癌具有多种发病原因且伴有多种肿瘤相关基因的分子突变。细胞连接分子(紧密连接、粘着连接、桥粒)在维护细胞极性及上皮细胞屏障方面起着重要作用,其表达异常与恶性肿瘤发生、发展有很大相关性。Symplekin是新近发现的紧密连接相关分子,紧密连接分子Symplekin是多定位与多功能的蛋白,除参与上皮细胞紧密连接的形成外,Symplekin还参与RNA3端腺苷酸化的过程,并且具有调节细胞增殖的作用。我们前期工作发现Symplekin在癌前病变、恶性病变的肝细胞中明显降低,可能参与肝细胞的恶性转化。研究紧密连接分子Symplekin在肝脏疾病中表达及调控机制对于阐明肝癌发生的机理及对于肝癌的预防和治疗具有十分重要的意义。
多种分子调控机制导致基因表达水平的降低,如:基因启动子区域的超甲基化现象,基因核心启动子区域的碱基缺失,炎症相关因子TNF-alpha和/或INF-gamma导致基因表达水平的下降以及microRNAs对于靶基因的下调作用。因此,本研究利用Bisulfite restrictionPCR、半定量PCR、q-RT-PCR、Western-blot等方法检测Symplekin在肝硬化、肝癌及多种癌细胞系中表达水平改变,及其在肝癌及肝癌细胞系中表达降低的机理——启动子区域发生CpG岛的甲基化;启动子区域缺失;细胞因子TNF-alpha和IFN-gamma对Symplekin表达水平的影响;MicroRNAs在癌细胞系中与Symplekin的相对表达情况。
实验结果显示(1)Symplekin在肝硬化和肝癌组织中mRNA表达水平呈下降趋势,Symplekin在癌细胞系如肝癌细胞系(HepG2、HuH-7)、肺癌细胞系(GLC,Spca-1,Ncih446,801D)、宫颈癌细胞系(Hela)、乳腺癌细胞系(Mcf-7)中表达均下降。(2)利用细胞因子TNF-alpha、INF-gamma同时处理HepG2细胞系,Symplekin mRNA、蛋白均表达下降。(3)应用q-RT-PCR检测5个细胞系中Symplekin、Mir-124的相对表达量,发现Mir-124和Symplekin表达量变化有相反趋势。(4)应用bisulfite restriction PCR对13例肝癌组织、10例肝硬化组织、4例正常肝组织以及肝癌细胞系HepG2、Huh7启动子区域甲基化状态进行检测,发现Symplekin启动子区域都无甲基化现象;(5)同时,对8例肝癌组织、10例正常肝组织、5例上皮细胞系及6例白血病细胞系启动子区域缺失进行检测,发现Symplekin启动子区域确实有碱基缺失,但其在肝癌组织、肝硬化组织、正常肝组织间没有统计学意义。
实验结果提示Symplekin很可能在肝细胞的恶性转化中起着重要的作用,此外Symplekin表达下降可能不仅参与肝癌发生且与其它肿瘤的发生具有相关性。推测在肝炎、肝硬化中,Symplekin的下降可能会导致紧密连接功能下降,肝胆管上皮屏障功能降低,CB(结合胆红素)返流入血中,可能也是造成黄疸形成的原因之一。在肝脏疾病炎症反应过程中,细胞因子可能会协同作用影响Symplekin的表达。Mir-124有可能直接负调控Symplekin的表达从而导致其表达降低。而Symplekin启动子区域甲基化或缺失与肝癌发生无相关性。
结论:(1)Symplekin在大部分肝炎、肝硬化、肝癌组织中mRNA表达水平呈下降趋势,这表明Symplekin很可能在肝细胞的恶性转化中起着重要的作用。(2)Symplekin在癌细胞系如肝癌细胞系(HepG2,HuH-7)肺癌细胞系(GLC,Spca-1,Ncih446,801D)、宫颈癌细胞系(Hela)、乳腺癌细胞系(Mcf-7)中表达均下降,这提示Symplekin表达下降可能不仅参与肝癌发生而且参与其它肿瘤的发生。(3)Symplekin启动子区域甲基化或缺失在肝癌、肝硬化及正常肝组织之间无显著性差异,表明在肝癌发生时Symplekin的表达下降可能与启动子DNA甲基化和缺失无关。(4)体外实验表明炎症细胞因子TNF-alpha与INF-gamma的协同参可能是体内Symplekin表达及调控的机制之一。(5)Mir-124对于Symplekin的负调控作用也可能是体内Symplekin表达及调控的机制之一。炎症细胞因子TNF-alpha与INF-gamma及Mir-124可能在肝脏疾病及肝癌发生过程中起着重要作用。