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第一部分糖尿病肾病小鼠肾脏LncRNA差异表达谱及功能分析背景:糖尿病肾病是一种常见的糖尿病慢性并发症,是导致终末期肾衰竭的重要原因。早期临床表现为微量白蛋白尿,病理学上可表现出系膜细胞增生、系膜基质增多、肾小球基底膜增厚、肾小球足细胞数量减少、密度减低、残留的足细胞代偿性肥大、足突增宽、融合。这些改变是导致糖尿病肾病患者蛋白尿形成的重要原因。但是,目前治疗糖尿病肾病的发病机制仍不完全明确。长链非编码RNA(lncRNA)是一类转录本长度大于200nt的非编码RNA,通过遗传水平、转录水平、转录后水平等多个层面调控基因表达,参与多种生物学过程。近年来,越来越多的lncRNAs被发现调控了糖尿病肾病的发生发展。截止目前,lncRNAs参与糖尿病肾病的机制仍不完全明确。本研究首次报道了多个与糖尿病肾病相关的lncRNAs,并探究了其参与糖尿病肾病的机制。目的:以糖尿病肾病db/db小鼠为模型,观察早期糖尿病肾病中lncRNAs的表达变化,筛选出与糖尿病肾病相关的lncRNAs,并对其功能进行生物学分析,以探讨其在糖尿病肾病中可能的作用机制。方法:(1)5周龄的雄性小鼠共12只,其中C57BL/KsJ db/db小鼠6只作为模型组,C57BL/KsJ db/m小鼠6只作为正常对照组。9周末处死两组小鼠,称体重,用代谢笼收集24h尿标本检测尿微量白蛋白,采血检测血糖,留取肾组织行HE、PAS染色。(2)小鼠肾组织进行lncRNA芯片分析,差异筛选lncRNAs和共表达的mRNA。挑选部分lncRNAs,采用实时荧光定量RT-PCR对小鼠肾脏组织(db/m、db/db)中lncRNAs的表达量进行测定。(3)通过Gene ontology(GO)、KEGG pathway、cis-和tans-等生物信息学分析,筛选出与糖尿病肾病相关的lncRNAs并分析其调控糖尿病肾病可能的机制。结果:(1)db/db模型组较db/m正常组小鼠:体重、血糖、24小时尿微量白蛋白水平均明显升高。肾脏HE和PAS染色结果示db/db模型组小鼠肾小球肥大,毛细血管基底膜增厚,系膜区增宽。(2)芯片结果发现与db/m正常组小鼠相比,db/db糖尿病肾病小鼠的肾皮质组织中共311条lncRNAs表达差异大于2倍,其中105条显著上调、206条显著下调。实时荧光定量RT-PCR分析发现,芯片结果分析挑选出差异表达的7条lncRNAs,在db/m正常组小鼠和db/db糖尿病肾病小鼠中表达量明显有差异,结果均具有显著性(P<0.05)。(3)GO和Pathway分析发现表达差异的lncRNAs与多个与糖尿病肾病相关的信号通路有关,如MAPK信号通路、溶酶体途径和谷胱甘肽代谢途径等。Cis-分析发现2条lncRNAs可能分别通过cis-调控Map2k1和THBS1基因参与糖尿病肾病的发生发展。Trans-分析发现272条lncRNAs可能与转录因子发生相互作用,这些转录因子中FOSB、JUNB、JUND、FOS、FOSL1、HNF4A等与糖尿病肾病的发生发展密切相关。结论:LncRNAs在糖尿病肾病早期存在差异表达;LncRNAs可能通过MAPK等信号通路参与糖尿病肾病的发生发展。第二部分MiR-205-5p激活wnt/β-catenin诱导高糖状态下足细胞凋亡背景:早期糖尿病肾病患者肾活检组织病理显示肾小球足细胞数量减少、密度减低,这些改变是导致糖尿病肾病患者蛋白尿形成的重要原因。越来越多的研究发现,足细胞的脱落、减少与高血糖诱导的肾小球足细胞凋亡有关。高糖引起足细胞凋亡可能与糖基化终末产物的形成、氧化应激、线粒体损伤、TGFβ-1增高、足细胞自噬下降有关,但是目前的机制仍不完全明确。MicroRNAs(MiRNAs)是长约22个核苷酸的非编码RNA,通过识别靶mRNA的3’端非编码区调控基因表达,越来越多的miRNA被发现参与了糖尿病肾病的进程。Wnt信号通路是一种进化上保守的信号通路,参与了多种肾脏疾病的发生,包括局灶硬化性肾病和糖尿病肾病等。本研究首次观察miR-205-5p是否可以促进高糖状态下足细胞凋亡,并探究了其通过wnt/β-catenin激活凋亡的分子机制。目的:观察miR-205-5p是否可以促进高糖状态下足细胞凋亡,以及是否通过wnt/β-catenin信号通路来促进高糖状态下足细胞凋亡。方法:(1)体外培养人足细胞,37℃C分化成熟,分为正常组(CON)、高糖组(HG)。Annexin V-FITC法检测足细胞凋亡率的改变;Western blot检测两组细胞中凋亡相关蛋白cleaved-caspase3的表达变化。qRT-PCR技术检测两组细胞中miR-205-5p 的表达。Western blot 检测 β-catenin 蛋白的表达量。(2)MiR-205-5p mimics和阴性对照瞬时转染正常人足细胞48h后Annexin V-FITC法检测足细胞凋亡率的改变,Western blot检测cleaved-caspase3蛋白和β-catenin蛋白的表达的变化;(3)体外培养人足细胞,予以XAV-939小分子选择性抑制剂干预,抑制Wnt通路转录因子β-catenin调节的转录,加用高糖刺激,Annexin V-FITC法检测足细胞凋亡率的改变,Western blot检测cleaved-caspase3蛋白表达的变化。结果:(1)与正常组相比,高糖诱导下足细胞凋亡增加;高糖组miR-205-5p表达量升高,β-catenin的表达增加。(2)与空载对照相比,miR-205-5p过表达后,正常糖培养下的足细胞凋亡增加、β-catenin的表达增加。(3)与高糖刺激的足细胞相比,高糖组加XAV-939干预后,足细胞β-catenin表达明显下降、足细胞凋亡明显减少。结论:MiR-205-5p通过激活wnt/β-catenin信号通路,从而诱导高糖下足细胞的凋亡。