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植物内生细菌(endophytic bacteria)是指定殖在植物组织内部但不引起明显病害症状的细菌。本研究在东祁连山珠芽蓼草地(Polygonum grassland)中选取优势种珠芽蓼(Polygonum viviparum),应用传统微生物学和分子生物学相结合的研究方法,分离筛选了具有固氮、溶磷、分泌生长素等功能的内生细菌,并对其定殖能力及对优势功能菌利用16Sr DNA技术进行了鉴定,主要取得了以下结果:1.珠芽蓼内生细菌的分离对珠芽蓼不同组织器官采用0.1%SDS浸泡15min、3%NaClO浸泡3min、0.1%升汞浸泡10min、75%酒精1~2min处理后(各步间用无菌水冲洗3~4次),研磨并稀释至10-3,取0.2mL涂布于TSA培养基,置28℃恒温培养5~7天的分离培养方法,从珠芽蓼的根、茎、叶、花各部分组织中分离得到大小、形态、颜色各异的内生细菌35株。2.功能菌的筛选对分离得到的35株内生细菌进行固氮能力、溶解无机磷能力、分泌IAA能力和分解纤维素能力进行了测定,得出6株菌(Z1,Z4,Z5,Z7,Z10,Z12)具有固氮能力,其中Z10在阿须贝无氮培养基上生长能力最强,液体培养3天就能观测出明显生长。6株菌(ZA6,ZC3,Z4,Z10,Z14,Z16)对无机磷具有溶解能力,其中Z10在PKO平板培养基上可产生明显的溶磷圈,在液体培养时溶磷能力最强,达到1111.15mg/L,其余菌株溶磷能力在150.42 mg/L -1091.88 mg/L之间。7株菌(ZA6,Z1,Z4,Z5,Z7,Z12,Z16)具有分泌IAA能力,在不加色氨酸的King培养基中,Z1的分泌能力最强,为17.01μg/mL,Z12最弱,为4.26μg/mL;在加色氨酸的King培养基中,Z5的分泌能力最强,为70.24μg/mL,Z7最低,为0.87μg/mL。10株菌(ZA6.ZC3,Z1,Z4,Z5,Z7,Z10,Z12,Z14,Z16)具有分解纤维素能力。Z4同时具有上述4种功能;Z10具有固氮、溶磷和分解纤维素的能力;Z1、Z5、Z7和Z12具有固氮、分泌IAA和分解纤维素的能力;Z16和ZA6具有溶磷、分泌IAA和分解纤维素的能力;Z14和ZC3具有溶磷和分解纤维素的能力,即筛选出了具有多种生理功能的内生菌株,为进一步开发提供了依据。3.优势功能菌的16SrDNA鉴定及其系统发育分析菌株Z1、Z4、Z5、Z7、Z10、Z12、Z14、Z16、ZC3经PCR扩增16S rDNA,测定的基因序列长度分别为:Z1(1456bp)、Z4(1472bp)、Z5(1462bp)、Z7(1472bp)、Z10(1443bp)、Z12(1488bp)、Z14(1476bp)、Z16(1458bp)、ZC3(1454bp),其序列与GenBank中已报道的序列比较,结合培养性状、染色反应、生理生化测定结果,初步确定菌株Z1,Z5,Z16为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),菌株Z4为荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens);菌株Z7,Z12为蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus);菌株Z10为普城沙雷氏菌(Serratia plymuthica);菌株Z14为短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus);菌株ZC3为嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)。4.内生细菌的定殖研究根据对50株内生细菌天然抗药性测定,筛选出17株对链霉素、卡那霉素、氨苄青霉素和利福平较敏感的菌株,对其采用2种抗生素标记,最后获得在抗生素浓度为70μg/ml的平板培养基上可生长的4种菌株,分别为R1(抗利福平和硫酸卡那霉素),X4(抗利福平和硫酸卡那霉素),Z10(抗硫酸链霉素和硫酸卡那霉素),ZB2(抗利福平和氨苄青霉素);将R1,X4,Z10,ZB2接回宿主植物,在乳白香青、线叶嵩中分别分离得到标记菌R1、X4,采用DGGE突变体检测,确定R1、X4在原寄主植物中可以定殖,但用R1,X4,Z10,ZB2接种燕麦、早熟禾、黑麦草、高羊茅、白三叶等植物,均未检测到相应菌株,表明其菌株寄主范围较窄,不能寄生在上述植物中。