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目的:鉴定p53过表达对Ki-67基因核心启动子活性的影响并探索其转录调控机制。
方法:使用ICH和RT-PCR技术检测p53对Ki-67基因表达的影响;双荧光素酶活性检测技术鉴定48小时内Ki-67基因核心启动子活性变化趋势以及p53过表达对其转录活性的影响;瞬时共转染实验检测p53过表达对Sp1所介导的Ki-67基因核心启动子活性上调的影响;ConTra启动子同源性分析系统检测Ki-67基因核心启动子区潜在的转录因子结合位点;定点突变技术分别构建p53结合模序和Sp1结合位点定点突变质粒;瞬时共转染和双荧光素酶活性检测技术鉴定Ki-67基因核心启动子区p53结合模序和Sp1结合位点在p53过表达所介导转录活性抑制中的作用。
结果:p53过表达显著抑制Ki-67基因的表达。48小时内Ki-67基因核心启动子的活性表现为先升高后降低的趋势,其中在24小时时达高峰。p53以剂量依赖的方式下调Ki-67基因核心启动子的基本转录活性。ConTra启动子同源性分析系统在Ki-67基因核心启动子区检测到两个p53结合模序。定点突变技术成功构建出3个p53结合模序突变质粒和3个Sp1结合位点突变质粒。p53结合模序突变后的Ki-67核心启动子活性较突变前有所上调,但仍受p53的抑制。p53以剂量依赖的方式抑制Sp1介导的Ki-67基因核心启动子活性的上调。随着核心启动子中Sp1突变位点数目的增加,Ki-67基因核心启动子的基本转录活性显著下降,而p53对其的抑制作用也相应减弱,当3个Sp1结合位点全部突变后p53几乎失去了对其的转录抑制活性;当核心启动子区的第一个和第三个Sp1结合位点突变后,启动子的转录活性较突变前有所上调。
结论:p53过表达通过p53和Sp1依赖的途径抑制Ki-67基因核心启动子的基本转录活性,下调Ki-67基因的表达:1.p53通过与p53结合模序的序列特异性相互作用发挥对Ki-67基因核心启动子的部分转录抑制活性;
2.Ki-67基因核心启动子区的第1个和第3个Sp1结合位点介导p53过表达对其的转录抑制活性。