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胰高血糖素样肽1受体(Glucagon-like peptide 1 receptor,GLP-1R)广泛存在于胰岛、中枢及外周神经系统、胃肠道、心脏及血管系统,属于G蛋白偶联受体(G-protein-coupled receptor,GPCR)B家族。在胰岛β细胞中,质膜上经典的GLP-1R在胰高血糖素样肽1(GLP-1)的控制下,经历脱敏、内化,最后再循环回到质膜,从而促进胰岛素释放,延迟胃排空、抑制食欲,因此被作为二型糖尿病的治疗靶点。GLP-1R在血管平滑肌细胞表达,且能在激动剂的作用下提供心血管保护作用。然而,GLP-1R在血管平滑肌细胞的亚细胞定位尚未明确。本论文围绕GLP-1R在大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞(RASMC)的亚细胞定位和核输入机制展开研究,主要研究内容包括以下几部分:第一部分:通过免疫荧光和免疫组化实验,观察了GLP-1R在大鼠主动脉中膜、肝脏、肾脏、胰腺组织,以及平滑肌细胞RASMC细胞、肝癌细胞、卵巢癌细胞、胰岛细胞等细胞系中的亚细胞定位。结果显示GLP-1R在动脉中膜和血管平滑肌细胞明显定位于细胞核,在其他组织和细胞中富集在细胞质和细胞膜。为了分析GLP-1R的核定位的分子机制,首先采用cNLS Mapper预测了GLP-1R可能存在的核定位序列(Nuclear localization signal,NLS),预测结果显示GLP-1R可能存在三段NLS,其中两段位于GLP-1R的跨膜结构域中,第三段位于GLP-1R C端。结合GLP-1R的结构,将其截短成N端(1-145aa)、跨膜区(146-408aa)、C端(409-463aa),并分别与绿色荧光蛋白(Green fluorescence protein,GFP)融合表达,重组质粒转染RASMC后观察这些截短体在细胞中的分布情况,结果显示只有GLP-1R的C末端(409-463aa)与GFP的融合蛋白定位于细胞核。进一步在全长GLP-1R中缺失预测的第三段NLS(412-442aa)和突变该段中所有的碱性氨基酸,分别与GFP融合表达,通过免疫荧光发现GFP-GLP-1R(△412-442)与GFP-NLSmutGLP-1R的核输入都受到了抑制,明显富集在细胞质中。因此,确定了(412-442aa)为GLP-1R的核定位序列,是其进入细胞核所必需的。其次,添加核输入经典途径importinα/β抑制剂Bimax2的结果显示GLP-1R的核输入受到抑制,初步确定了GLP-1R通过经典途径入核,体外GST-Pull down实验证实了GLP-1R与importinα的相互作用,一旦NLS突变后这种相互作用消失。这些结果表明GLP-1R通过其NLS(412-442aa)与importinα/β结合进入细胞核。第二部分:为了探究磷酸化对GLP-1R核输入的影响,在全长GLP-1R中逐步截短其C末端的5对Ser、突变NLS中416位的Ser,通过免疫荧光观察到截短的5对Ser对GLP-1R的核定位没有影响;但是当Ser416突变为Asp(GLP-1R S416D,模拟磷酸化)时,GLP-1R明显分布在细胞质中,核输入受到抑制;相反,突变为Ala(GLP-1R S416A,模拟去磷酸化)时,GLP-1R仍然能进行正常的核输入。表明NLS内的Ser416的磷酸化调控GLP-1R的核输入。体外GST-Pull down实验,揭示GLP-1R S416D不再与importinα的相互作用。GLP-1R Ser416的磷酸化是通过影响NLS与importinα的相互作用进而影响该蛋白的核输入。加入蛋白激酶C(PKC)激活剂佛波酯(PMA)处理后,观察到内源性GLP-1R的核输入受到抑制,而GFP-GLP-1R S416A仍然定位在细胞核中,表明PKC或者其下游的激酶通过磷酸化Ser416抑制GLP-1R的核输入。最后,通过突变NLS中的碱性氨基酸(GFP-NLSmutGLP-1R)、模拟磷酸化(GFP-GLP-1R S416D)使GLP-1R滞留在细胞质内,经MTT、细胞克隆形成实验、western blot分析了在RASMC细胞的胞质中GLP-1R增加对细胞的功能的影响,结果显示GLP-1R定位在细胞质中明显促进了RASMC细胞的增殖。综上所述,在血管平滑肌细胞中,GLP-1R在C末端存在一段NLS,通过经典核输入途径在importinα/β的作用下进入细胞核。NLS的Ser416被磷酸化后,GLP-1R从RASMC细胞核进入细胞质,且核中GLP-1R的缺失会明显促进细胞增殖。这些发现可能为进一步了解GLP-1R在心血管系统中的功能提供研究基础。