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研究背景器官移植后器官功能维持的主要障碍是术后排斥反应和免疫抑制剂的毒性。基因治疗为肝移植领域供肝抵抗移植后排斥反应和损伤提供了新的治疗思路。将免疫调节基因导入移植肝内,使其表达致耐受分子,产生能抑制受体免疫反应的细胞因子,可有效地抑制排斥反应的发生和增强移植肝的保护功能,能在不用或少量使用免疫抑制剂的情况下延长移植肝存活,甚至长期存活。程序性死亡配体-1(Programmed Death Ligand-1, PD-L1)是一种重要的抑制性共刺激分子,可通过激活初始T细胞、抑制活化的效应T细胞及调节细胞因子的分泌等参与多种免疫过程。体外研究发现:PD-L1与其受体程序性死亡-1(Programmed Death-1, PD-1)结合后,能抑制活化T细胞增殖及细胞因子的产生。动物实验也证实,在心脏、胰岛、角膜、皮肤等多种器官移植模型中,PD-L1均能抑制排斥反应及延长移植物的存活;这强烈提示了PD-L1可能具有保护移植肝免受排斥反应损伤的治疗潜能。PD-L1可通过多种机制产生免疫抑制效应,与肝移植联系起来考虑,它可能通过抑制活化T细胞的增殖及细胞因子的合成、分泌,从而阻断宿主对移植肝的攻击。此外,免疫抑制分子的局部表达有可能减少其全身性副作用、增加其生物利用度及治疗效应,因此是减轻排斥反应、促进移植物长期存活的很有前景的方法。腺相关病毒(Adeno-associated Virus, AAV)是移植物保护分子转染和表达的理想载体。报告基因红色荧光蛋白(Red Fluorescent Protein, RFP)因其具有灵敏度高、信号清楚等特点亦日益受到关注。研究目的基于以上分析,本研究拟通过建立近交系大鼠原位肝移植模型,以RFP为报告基因,将AAV作为PD-L1的载体,采用冷保存期门静脉灌注夹闭法转染供肝,观察其安全性和有效性。在此基础上,于活体内观察PD-L1基因转染对大鼠异基因肝移植术后肝脏的保护作用及其与亚剂量CsA的协同效果,并通过检测PD-L1对移植肝CD4+、CD8+、CD25+淋巴细胞浸润及细胞因子INF-γ、IL-17、IL-10、TGF-β1表达的影响,试图阐明PD-L1在抑制大鼠肝移植急性排斥反应中的可能机制。方法与结果第一部分近交系大鼠肝移植急性排斥模型的建立及排斥反应观察大鼠随机分为3组:①G1(同基因肝移植组);②G2(异基因肝移植组);③G3(CsA组,移植后0～7d腹腔注射CsA 2.5mg/Kg.d,余同G2)。采用改良“二袖套法”建立大鼠肝移植急性排斥模型。术后观察一般情况、平均存活时间(Median Survival Time, MST),分别在术后3、7、14及21d采用全自动生化分析仪检测肝功能,光镜下观察移植肝组织学变化,根据Banff标准判断排斥反应强度。结果表明:在无外界干预的情况下,G1大鼠无急性排斥表现;G2受体多在术后7d出现耳廓黄染、尿黄等,至14d进行性加重伴血性腹水等;G3用药期间大鼠精神差,停药后逐渐恢复,至14d出现轻度急排表现;三组大鼠MST分别为:G1(106.7±0.24)d,G2(18.3±1.15)d和G3(28.7±0.98)d,G3较G2明显延长,差异显著(P<0.05);肝功及肝组织病理学改变早于上述表现,术后3d急排大鼠ALT、TBIL明显升高伴轻度的排斥反应病理改变,7d后上述指标进一步恶化,至14d最为典型,与G1、G3相比差异显著(P<0.05);各时段排斥分级与病理变化趋势一致:术后3d G3与G2急性排斥活动指数(Rejection Activity Index, RAI)评分无明显差异,而7d、14d及21d G2 RAI评分明显高于G1、G3 (P<0.05)。第二部分重组PD-L1-AAV2-RFP转染大鼠移植肝的安全性和有效性1.重组PD-L1-AAV2-RFP载体PCR鉴定:以重组载体为模板,在PCR仪上进行扩增反应,取PCR产物行1%琼脂糖凝胶电泳,紫外灯下观察发现扩增条带与预期的891bp大小的特异性条带相吻合,表明PD-L1基因构建正确。2.重组PD-L1-AAV2-RFP载体感染活性检测:重组病毒感染BHK细胞后荧光显微镜下观察RFP基因表达。结果表明PD-L1-AAV2-RFP感染后24h即可观察到红色荧光,48h后转染率可达30%,表明其具有较强的感染活性,可用于体内外转染研究。3.大鼠随机分为3组:①G1(同基因肝移植组);②G2(AAV空载体组,供肝切取后经门静脉灌注AAV2-RFP空病毒液夹闭冷转染供肝2h,移植前乳酸林格氏液经门静脉冲洗供肝,余同G1);③G3(PD-L1转染组,所用灌注液为PD-L1-AAV2-RFP,余同G2)。改良“二袖套法”建立大鼠肝移植基因转染模型,于荧光显微镜下观察移植肝RFP的表达,分别采用实时荧光定量RT-PCR、IHC从mRNA及蛋白水平检测移植肝PD-L1的表达,肝功能及肝组织病理检测同第一部分。结果发现:ALT与TBIL分别于术后3d、7d达到峰值,14d基本恢复正常,各组间无显著性差异;与未转染组相比,PD-L1转染后肝组织病理未见明显差异;G2、G3术后7d即可在荧光显微镜下观察到微弱的红色荧光,14、21d逐渐增强,呈高亮度的红色荧光,而三组大鼠肝外器官中始终无红色荧光;RT-PCR及IHC检测显示未转染组PD-L1mRNA基因和蛋白均微弱表达;PD-L1转染7d后随时间延长靶基因表达逐渐增强,21d达峰值,主要位于汇管区周围;除3d外,余各时段PD-L1基因转录及蛋白表达G3较G1、G2明显增强(P<0.05)。第三部分腺相关病毒介导的PD-L1表达对大鼠移植肝的保护作用及其机制大鼠随机分为6组:①G 1(同基因肝移植组);②G2(异基因肝移植组);③G3(AAV空载体组,供肝切取后经门静脉灌注AAV2-RFP空病毒液夹闭冷转染供肝2h,移植前乳酸林格氏液经门静脉冲洗供肝,余同G2);④G4(CsA组,移植后0～7d予腹腔注射CsA 2.5mg/kg.d,余同G2);⑤G5(PD-L1转染组,所用灌注液为PD-L1-AAV2-RFP,余同G3);⑥G6(联合治疗组,所用灌注液为PD-L1-AAV2-RFP,术后0～7d予腹腔注射CsA 2.5mg/kg.d,余同G2)。改良“二袖套法”建立大鼠肝移植模型,利用组织病理、IHC、ELISA等技术,观察术后移植肝病理改变、PD-L1蛋白表达及其对移植肝CD4+、CD8+、CD25+细胞浸润和细胞因子INF-γ、IL-17、IL-10、TGF-β1表达的影响。结果显示:G1大鼠无急性排斥表现;肝功能损害较轻,ALT与TBIL分别于术后3d、7d达到峰值,14d基本恢复正常;肝脏病理学呈Banff 0级排斥反应;各时段PD-L1蛋白微弱表达;汇管区未见明显淋巴细胞浸润;IFN-γ无明显表达,而IL-17、IL-10和TGF-β1呈低表达;大鼠MST为(106.7±0.24)d。G2、G3 7d开始出现急排表现,14d症状加重;肝功能指标明显恶化;肝脏病理学呈BanffⅡ～Ⅲ级排斥反应,RAI评分随时间推移逐渐升高;各时段PD-L1蛋白微弱表达;移植肝大量CD4+、CD8+、CD25+细胞浸润;细胞因子IFN-γ、IL-17上调表达,而IL-10、TGF-β1表达下降;大鼠MST为(18.3±1.15)d、(18.3±0.72)d。与G2、G3相比,G4、G5及G6大鼠发生急性排斥反应的时间均明显延迟,直至14d才出现轻度排斥表现;肝功能部分改善,术后出现ALT、TBIL再次升高及肝功能衰竭的时间明显推迟;肝脏病理学呈BanffⅠ～Ⅱ级排斥反应;G5、G6各时段移植肝PD-L1蛋白的表达随时间逐渐增强,G4无明显变化;移植肝CD4+、CD8+、CD25+细胞浸润明显减少,尤以CD8+细胞为著(P<0.05);移植肝细胞因子IFN-γ、IL-17含量显著下降,而IL-10、TGF-β1含量明显升高,差异显著(P<0.05);受体MST明显延长,但未获得长期存活,仅为(28.7±0.98)d、(29.3±1.47)d。PD-L1基因转染联合亚剂量CsA治疗的大鼠各时段肝功能损害进一步减轻,RAI评分显著降低,受体MST明显延长至(34.0±1.49)d (P<0.05)。四、结论1.采用改良“二袖套法”成功建立了LEW-BN组合大鼠肝移植急性排斥模型。2.冷保存期经门静脉灌注PD-L1-AAV2-RFP夹闭法转染供肝,可安全、有效地将目的基因转染至大鼠移植肝内并分泌功能性蛋白。3.在本实验条件下,采用PD-L1-AAV2-RFP(1×1011v.g./只)经门静脉灌注夹闭冷保存2h是介导足量蛋白表达的理想方案。4.腺相关病毒介导的PD-L1基因转染对移植肝具有显著的保护作用,可延长移植肝存活,且与CsA有协同效果。5. PD-L1基因可抑制肝移植急性排斥反应,其机制可能是PD-L1基因转染增强了PD-L1/PD-1信号通路,通过抑制移植肝CD4+、CD8+、CD25+T细胞浸润及其功能,在上调细胞因子IL-10、TGF-β1表达的同时,下调INF-γ、IL-17的表达,从而发挥对移植肝的保护作用。