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研究背景
结直肠癌的发生进展是由多基因参与、多因素作用、多步骤调控的复杂病理过程。近年来，随着相关研究的不断深入和发展，结直肠癌的发生进展机制和个体化治疗水平都取得了较大进展，但由于存在异质性，结直肠癌患者对治疗的反应性和临床预后存在明显差异。因此，深入研究结直肠癌进展机制，揭示结直肠癌进展关键分子靶点，寻找高敏感性和高特异性的循环标志物用于结直肠癌的无创性诊断仍是目前临床关注的焦点。近年来，长链非编码RNAs(long non-coding RNAs，lncRNAs)因其重要的调控功能而受到广泛关注，其可通过转录调控、翻译调控、RNA编辑、染色质重塑和microRNA(miRNA)海绵等活动参与肿瘤细胞增殖、迁移、侵袭、凋亡及周期等生物过程。与此同时，大量lncRNAs被证实在多种肿瘤中都异常表达，且具有发育阶段、疾病和组织特异性，有望成为一种潜在的可用于临床诊断及预后预测的新型标志物。因此，深入探索lncRNAs调控网络在结直肠癌进展中的生物学功能及分子机制，不仅可以从一个全新的角度揭示结直肠癌进展的分子机理，同时能够为结直肠癌的临床诊断和预后预测提供新型分子标志物。
鉴于此，本研究基于癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas，TCGA)分析lncRNAs在结直肠癌组织中的差异表达及其对患者的预后预测价值，选取lncRNAAC010789.1进行深入研究;通过体外细胞实验和体内动物模型探究AC010789.1对结直肠癌细胞增殖能力、迁移及侵袭能力和上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)的影响，明确AC010789.1对结直肠癌细胞生物学功能的影响;运用转录组测序(RNA sequencing)、双荧光素酶报告基因实验、westernblot以及实时荧光定量聚合酶链反应(quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR)分析AC010789.1参与结直肠癌进展的具体机制;进一步检测血清中AC010789.1的表达水平，并分析其对结直肠癌的临床诊断价值。综上所述，本研究从TCGA数据库分析入手，深入探讨了AC010789.1对结直肠癌细胞恶性生物学行为的影响及作用机制，明确了其作为结直肠癌诊断标志物的可能性，不仅为阐明结直肠癌进展机制提供有效补充，而且为结直肠癌患者临床诊疗提供新思路。
第一部分结直肠癌中AC010789.1的表达及预后价值研究
目的:
分析AC010789.1在结直肠癌组织中的表达，并探讨其对结直肠癌患者预后预测的临床价值。
方法:
1.通过TCGA数据库下载结直肠癌患者及健康对照者lncRNAs表达谱数据，利用“DESeq2”软件包筛选差异表达的lncRNAs。
2.整合TCGA数据库中结直肠癌患者随访信息，通过单因素Cox回归分析和Kaplan-Meier生存曲线分析获得与患者预后相关的lncRNAs。
3.通过原位杂交(in situ hybridization，ISH)实验和qRT-PCR实验检测目的lncRNA在结直肠癌和癌旁正常组织中的表达水平，分析目的lncRNA与结直肠癌患者生存期和临床病理参数之间的关系。
结果:
1.从TCGA数据库共下载647例结直肠癌患者和51例健康对照者的lncRNAs表达谱数据。以|log2foldchange|＞3且P＜0.05为筛选标准，共获得435个差异表达的lncRNAs。
2.对上述差异表达的lncRNAs进行单因素Cox回归分析和Kaplan-Meier生存曲线分析，获得11个与结直肠癌患者总生存期相关的lncRNAs，其中，AC010789.1的高表达与结直肠癌患者的不良预后显著相关。
3.ISH实验分析结果表明，AC010789.1在结直肠癌组织中的表达水平呈显著高表达，而且AC010789.1高表达患者总生存期低于AC010789.1低表达患者，差异具有统计学意义。
4.QRT-PCR结果显示，与癌旁正常组织相比，AC010789.1在结直肠癌组织中显著高表达。同时，结直肠癌组织AC010789.1的表达水平与患者淋巴结转移状态显著相关，而与结直肠癌患者年龄、性别和肿瘤T分期无关。
结论:
AC010789.1的表达水平在结直肠癌组织中显著上调，而且与结直肠癌患者的预后及淋巴结转移状态具有显著相关性，提示其可能参与结直肠癌的进展，具有潜在的临床应用价值。
第二部分AC010789.1对结直肠癌细胞生物学功能的影响
目的:
通过体外细胞实验和体内动物模型探讨AC010789.1对结直肠癌细胞增殖、迁移、侵袭和EMT的影响。
方法:
1.通过qRT-PCR实验检测结直肠癌细胞系(HCT116、SW1116、SW480、HT29及DLD1)和人正常结直肠粘膜细胞FHC中AC010789.1的表达水平。
2.通过小干扰RNA(siRNA)或慢病毒构建AC010789.1敲减细胞株，运用过表达质粒上调AC010789.1的表达。AC010789.1敲减或过表达水平通过qRT-PCR进行验证。
3.利用实时无标记细胞分析(real time cell analysis，RTCA)实验、平板克隆形成实验和transwell实验验证敲减或过表达AC010789.1后结直肠癌细胞增殖、克隆形成、迁移和侵袭能力的改变。
4.通过qRT-PCR、westernblot和免疫荧光实验检测敲减或过表达AC010789.1对结直肠癌细胞EMT能力的影响。
5.运用裸鼠皮下成瘤实验检测AC010789.1敲减后对肿瘤增殖的影响。通过裸鼠尾静脉注射AC010789.1稳定敲减细胞株建立实验性转移模型，检测AC010789.1敲减后对结直肠癌细胞转移能力的影响。
结果:
1.QRT-PCR结果显示，AC010789.1在结直肠癌细胞系中的表达水平均高于人正常结直肠粘膜细胞FHC。其中，HCT116和SW1116细胞中AC010789.1的表达水平相对较高，用于后续敲减实验;DLD1和HT29细胞中AC010789.1的表达水平相对较低，用于后续过表达实验。
2.根据AC010789.1序列设计的siRNA对AC010789.1具有较好的敲减效率，进一步利用慢病毒载体成功构建AC010789.1稳定敲减细胞株。同时，AC010789.1过表达质粒可以有效提高AC010789.1在DLD1和HT29细胞系中的表达水平。
3.RTCA实验、平板克隆形成实验、transwell迁移和侵袭实验显示，相比于对照组，敲减AC010789.1会显著抑制结直肠癌细胞的增殖、克隆形成、迁移和侵袭能力。相反，过表达AC010789.1会增强结直肠癌细胞的增殖、克隆形成、迁移和侵袭能力。
4.Westernblot和qRT-PCR实验结果显示，敲减AC010789.1后，E钙粘蛋白(E-cadherin)的蛋白和mRNA水平均升高，波形蛋白(vimentin)的蛋白和mRNA水平均降低，而过表达AC010789.1后出现相反的变化趋势。免疫荧光实验结果显示，敲减AC010789.1后E-cadherin免疫荧光染色明显增强，vimentin免疫荧光染色明显减弱。
5.裸鼠成瘤实验显示，与对照组相比，AC010789.1稳定敲减组的肿瘤增殖速度明显减慢，重量明显减轻，ki-67阳性细胞数明显减少。同时，与对照组相比，AC010789.1稳定敲减组的肺转移结节显著减少。这些结果提示敲减AC010789.1会在体内抑制肿瘤的增殖和转移。
结论:
AC010789.1作为癌基因促进结直肠癌细胞的增殖、克隆形成、迁移、侵袭和EMT过程，有望成为结直肠癌治疗的新靶点。
第三部分AC010789.1在结直肠癌进展中的分子机制研究
目的:
探讨AC010789.1促进结直肠癌进展的分子调控网络，为进一步研究结直肠癌进展机制和潜在治疗靶点提供新的视角。
方法:
1.通过核质分离实验分析AC010789.1在细胞中的定位。
2.利用LncBasePredictedv.2、TargetScan数据库、RNAsequencing和生物信息学预测方法构建AC010789.1-miRNA-mRNA调控网络。
3.通过qRT-PCR和westernblot验证AC010789.1、miRNA和下游靶基因之间表达量的调控关系，运用spearman相关分析评估临床样本中AC010789.1、miRNA和mRNA表达量的相关性。通过双荧光素酶报告基因实验验证AC010789.1和miRNA以及miRNA和mRNA之间的结合关系。
4.通过qRT-PCR和westernblot检测AC010789.1对wnt/β-catenin通路活性的影响。
5.运用体外细胞实验探讨miR-432-3p对结直肠癌细胞生物学功能的影响。
6.通过挽救实验验证AC010789.1通过miRNA促进结直肠癌细胞增殖、迁移、侵袭和EMT的作用机制。
结果:
1.核质分离实验结果显示，AC010789.1在HCT116和SW1116细胞的胞质与胞核中均有表达。
2.通过LncBasePredictedv.2数据库和相关文献共筛选到3个可以与AC010789.1结合的miRNAs(miR-432-3p、miR-7854-3p和miR-4796-3p)。QRT-PCR结果显示，敲减AC010789.1后，miR-432-3p表达量升高最为明显，因此选取miR-432-3p作为候选miRNA。
3.敲减AC010789.1后进行RNAsequencing，以|log2foldchange|＞1且P＜0.05为筛选标准，共获得5735个差异表达的mRNAs，其中2971个mRNAs下调，2764个mRNAs上调。通过GO功能注释分析发现，差异表达mRNAs的功能主要集中在细胞增殖、粘附和迁移等方面。联合RNAsequencing及TargetScan数据库分析，明确ZEB1在AC010789.1敲减组表达下调，且其3UTR含有miR-432-3p的结合位点，因此选取ZEB1作为下游靶基因进行后续研究。
4.QRT-PCR结果表明敲减或者过表达miR-432-3p后AC010789.1表达量明显升高或降低。此外，敲减AC010789.1或过表达miR-432-3p后ZEB1的mRNA和蛋白水平均明显降低。相反，过表达AC010789.1或敲减miR-432-3p后ZEB1的mRNA和蛋白水平均明显升高。Spearman相关分析表明，AC010789.1和miR-432-3p以及miR-432-3p和ZEB1的表达水平在结直肠癌组织中均呈负相关，AC010789.1和ZEB1的表达水平在结直肠癌组织中呈正相关。双荧光素酶报告基因实验显示，AC010789.1和miR-432-3p以及miR-432-3p和ZEB1之间存在结合关系。挽救实验证实ZEB1过表达可部分逆转miR-432-3p过表达对ZEB1表达的抑制作用，抑制miR-432-3p表达后可部分逆转AC010789.1敲减导致的ZEB1mRNA和蛋白水平的降低。
5.通过对RNAsequencing中产生的差异表达的mRNAs进行GO功能注释和KEGG富集分析，发现其主要影响wnt信号通路，其中wnt/β-catenin通路的异常活化与多种肿瘤的发生进展密切相关，因此我们验证了AC010789.1与wnt/β-catenin通路活性的关系。Westernblot结果显示，与对照组相比，AC010789.1稳定敲减组的细胞核β-catenin及总β-catenin蛋白水平均明显降低，而过表达AC010789.1组的细胞核β-catenin及总β-catenin蛋白水平均明显升高。但是，无论敲减还是过表达AC010789.1都不影响细胞质β-catenin蛋白的表达。而且，AC010789.1敲减组中wnt/β-catenin通路下游靶基因cMyc和cyclinD1的蛋白水平明显降低，AC010789.1过表达组中cMyc和cyclinD1的蛋白水平明显升高。此外，敲减miR-432-3p后可部分逆转AC010789.1敲减介导的细胞核β-catenin、cMyc和cyclinD1蛋白的降低。
6.Transwell实验显示，过表达miR-432-3p后结直肠癌细胞迁移和侵袭的能力明显减弱，敲减miR-432-3p后结直肠癌细胞迁移和侵袭的能力明显增强。Westernblot和qRT-PCR实验结果显示，过表达miR-432-3p后E-cadherin的蛋白和mRNA水平均升高，vimentin的蛋白和mRNA水平均降低，敲减miR-432-3p后出现相反的变化趋势。挽救实验证实ZEB1过表达可部分恢复miR-432-3p过表达导致的结直肠癌细胞迁移及侵袭能力的减弱。
7.RTCA实验、平板克隆形成实验、transwell迁移、侵袭实验和免疫荧光实验表明AC010789.1可以通过miR-432-3p促进结直肠癌细胞的增殖、克隆形成、迁移、侵袭和EMT。
结论:
AC010789.1通过miR-432-3p调控ZEB1的表达和wnt/β-catenin通路的活性，进而调控结直肠癌细胞的增殖、迁移、侵袭和EMT。
第四部分血清AC010789.1在结直肠癌中的诊断价值研究
目的:
检测结直肠癌患者和健康对照者血清中AC010789.1的表达水平，分析其对结直肠癌诊断的临床价值。
方法:
1.通过qRT-PCR检测72例结直肠癌患者和72例健康对照者血清中AC010789.1的表达水平，并评估-80℃冰箱保存时间、反复冻融次数以及室温条件放置时间对血清中AC010789.1表达稳定性的影响。
2.采用Mann-WhitneyU检验统计分析血清AC010789.1表达水平与结直肠癌患者临床病理参数之间的关系。
3.利用受试者工作曲线(receiver operating characteristic curve，ROC)下面积(area under curve，AUC)评估血清AC010789.1表达水平对结直肠癌的诊断效能。
结果:
1.QRT-PCR结果显示，与健康对照者相比，结直肠癌患者血清中AC010789.1的表达水平显著升高。血清样本在-80℃冰箱放置1个月、2个月或3个月，反复冻融2次、4次或8次以及室温条件下放置4小时、8小时、12小时或24小时后AC010789.1的表达水平无明显变化。
2.通过Mann-WhitneyU检验分析结直肠癌患者血清中AC010789.1表达水平和临床病理参数的关系，结果显示结直肠癌患者血清中AC010789.1表达水平与肿瘤T分期显著相关，而与年龄、性别及淋巴结转移状态无关。
3.ROC曲线分析发现，AC010789.1对结直肠癌诊断的AUC为0.861(95％CI:0.794-0.913)，诊断敏感性为77.8％，特异性为83.3％。
结论:
血清AC010789.1有望成为结直肠癌新型生物标志物，为结直肠癌的无创性诊断提供了新的途径。
结直肠癌的发生进展是由多基因参与、多因素作用、多步骤调控的复杂病理过程。近年来，随着相关研究的不断深入和发展，结直肠癌的发生进展机制和个体化治疗水平都取得了较大进展，但由于存在异质性，结直肠癌患者对治疗的反应性和临床预后存在明显差异。因此，深入研究结直肠癌进展机制，揭示结直肠癌进展关键分子靶点，寻找高敏感性和高特异性的循环标志物用于结直肠癌的无创性诊断仍是目前临床关注的焦点。近年来，长链非编码RNAs(long non-coding RNAs，lncRNAs)因其重要的调控功能而受到广泛关注，其可通过转录调控、翻译调控、RNA编辑、染色质重塑和microRNA(miRNA)海绵等活动参与肿瘤细胞增殖、迁移、侵袭、凋亡及周期等生物过程。与此同时，大量lncRNAs被证实在多种肿瘤中都异常表达，且具有发育阶段、疾病和组织特异性，有望成为一种潜在的可用于临床诊断及预后预测的新型标志物。因此，深入探索lncRNAs调控网络在结直肠癌进展中的生物学功能及分子机制，不仅可以从一个全新的角度揭示结直肠癌进展的分子机理，同时能够为结直肠癌的临床诊断和预后预测提供新型分子标志物。
鉴于此，本研究基于癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas，TCGA)分析lncRNAs在结直肠癌组织中的差异表达及其对患者的预后预测价值，选取lncRNAAC010789.1进行深入研究;通过体外细胞实验和体内动物模型探究AC010789.1对结直肠癌细胞增殖能力、迁移及侵袭能力和上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)的影响，明确AC010789.1对结直肠癌细胞生物学功能的影响;运用转录组测序(RNA sequencing)、双荧光素酶报告基因实验、westernblot以及实时荧光定量聚合酶链反应(quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR)分析AC010789.1参与结直肠癌进展的具体机制;进一步检测血清中AC010789.1的表达水平，并分析其对结直肠癌的临床诊断价值。综上所述，本研究从TCGA数据库分析入手，深入探讨了AC010789.1对结直肠癌细胞恶性生物学行为的影响及作用机制，明确了其作为结直肠癌诊断标志物的可能性，不仅为阐明结直肠癌进展机制提供有效补充，而且为结直肠癌患者临床诊疗提供新思路。
第一部分结直肠癌中AC010789.1的表达及预后价值研究
目的:
分析AC010789.1在结直肠癌组织中的表达，并探讨其对结直肠癌患者预后预测的临床价值。
方法:
1.通过TCGA数据库下载结直肠癌患者及健康对照者lncRNAs表达谱数据，利用“DESeq2”软件包筛选差异表达的lncRNAs。
2.整合TCGA数据库中结直肠癌患者随访信息，通过单因素Cox回归分析和Kaplan-Meier生存曲线分析获得与患者预后相关的lncRNAs。
3.通过原位杂交(in situ hybridization，ISH)实验和qRT-PCR实验检测目的lncRNA在结直肠癌和癌旁正常组织中的表达水平，分析目的lncRNA与结直肠癌患者生存期和临床病理参数之间的关系。
结果:
1.从TCGA数据库共下载647例结直肠癌患者和51例健康对照者的lncRNAs表达谱数据。以|log2foldchange|＞3且P＜0.05为筛选标准，共获得435个差异表达的lncRNAs。
2.对上述差异表达的lncRNAs进行单因素Cox回归分析和Kaplan-Meier生存曲线分析，获得11个与结直肠癌患者总生存期相关的lncRNAs，其中，AC010789.1的高表达与结直肠癌患者的不良预后显著相关。
3.ISH实验分析结果表明，AC010789.1在结直肠癌组织中的表达水平呈显著高表达，而且AC010789.1高表达患者总生存期低于AC010789.1低表达患者，差异具有统计学意义。
4.QRT-PCR结果显示，与癌旁正常组织相比，AC010789.1在结直肠癌组织中显著高表达。同时，结直肠癌组织AC010789.1的表达水平与患者淋巴结转移状态显著相关，而与结直肠癌患者年龄、性别和肿瘤T分期无关。
结论:
AC010789.1的表达水平在结直肠癌组织中显著上调，而且与结直肠癌患者的预后及淋巴结转移状态具有显著相关性，提示其可能参与结直肠癌的进展，具有潜在的临床应用价值。
第二部分AC010789.1对结直肠癌细胞生物学功能的影响
目的:
通过体外细胞实验和体内动物模型探讨AC010789.1对结直肠癌细胞增殖、迁移、侵袭和EMT的影响。
方法:
1.通过qRT-PCR实验检测结直肠癌细胞系(HCT116、SW1116、SW480、HT29及DLD1)和人正常结直肠粘膜细胞FHC中AC010789.1的表达水平。
2.通过小干扰RNA(siRNA)或慢病毒构建AC010789.1敲减细胞株，运用过表达质粒上调AC010789.1的表达。AC010789.1敲减或过表达水平通过qRT-PCR进行验证。
3.利用实时无标记细胞分析(real time cell analysis，RTCA)实验、平板克隆形成实验和transwell实验验证敲减或过表达AC010789.1后结直肠癌细胞增殖、克隆形成、迁移和侵袭能力的改变。
4.通过qRT-PCR、westernblot和免疫荧光实验检测敲减或过表达AC010789.1对结直肠癌细胞EMT能力的影响。
5.运用裸鼠皮下成瘤实验检测AC010789.1敲减后对肿瘤增殖的影响。通过裸鼠尾静脉注射AC010789.1稳定敲减细胞株建立实验性转移模型，检测AC010789.1敲减后对结直肠癌细胞转移能力的影响。
结果:
1.QRT-PCR结果显示，AC010789.1在结直肠癌细胞系中的表达水平均高于人正常结直肠粘膜细胞FHC。其中，HCT116和SW1116细胞中AC010789.1的表达水平相对较高，用于后续敲减实验;DLD1和HT29细胞中AC010789.1的表达水平相对较低，用于后续过表达实验。
2.根据AC010789.1序列设计的siRNA对AC010789.1具有较好的敲减效率，进一步利用慢病毒载体成功构建AC010789.1稳定敲减细胞株。同时，AC010789.1过表达质粒可以有效提高AC010789.1在DLD1和HT29细胞系中的表达水平。
3.RTCA实验、平板克隆形成实验、transwell迁移和侵袭实验显示，相比于对照组，敲减AC010789.1会显著抑制结直肠癌细胞的增殖、克隆形成、迁移和侵袭能力。相反，过表达AC010789.1会增强结直肠癌细胞的增殖、克隆形成、迁移和侵袭能力。
4.Westernblot和qRT-PCR实验结果显示，敲减AC010789.1后，E钙粘蛋白(E-cadherin)的蛋白和mRNA水平均升高，波形蛋白(vimentin)的蛋白和mRNA水平均降低，而过表达AC010789.1后出现相反的变化趋势。免疫荧光实验结果显示，敲减AC010789.1后E-cadherin免疫荧光染色明显增强，vimentin免疫荧光染色明显减弱。
5.裸鼠成瘤实验显示，与对照组相比，AC010789.1稳定敲减组的肿瘤增殖速度明显减慢，重量明显减轻，ki-67阳性细胞数明显减少。同时，与对照组相比，AC010789.1稳定敲减组的肺转移结节显著减少。这些结果提示敲减AC010789.1会在体内抑制肿瘤的增殖和转移。
结论:
AC010789.1作为癌基因促进结直肠癌细胞的增殖、克隆形成、迁移、侵袭和EMT过程，有望成为结直肠癌治疗的新靶点。
第三部分AC010789.1在结直肠癌进展中的分子机制研究
目的:
探讨AC010789.1促进结直肠癌进展的分子调控网络，为进一步研究结直肠癌进展机制和潜在治疗靶点提供新的视角。
方法:
1.通过核质分离实验分析AC010789.1在细胞中的定位。
2.利用LncBasePredictedv.2、TargetScan数据库、RNAsequencing和生物信息学预测方法构建AC010789.1-miRNA-mRNA调控网络。
3.通过qRT-PCR和westernblot验证AC010789.1、miRNA和下游靶基因之间表达量的调控关系，运用spearman相关分析评估临床样本中AC010789.1、miRNA和mRNA表达量的相关性。通过双荧光素酶报告基因实验验证AC010789.1和miRNA以及miRNA和mRNA之间的结合关系。
4.通过qRT-PCR和westernblot检测AC010789.1对wnt/β-catenin通路活性的影响。
5.运用体外细胞实验探讨miR-432-3p对结直肠癌细胞生物学功能的影响。
6.通过挽救实验验证AC010789.1通过miRNA促进结直肠癌细胞增殖、迁移、侵袭和EMT的作用机制。
结果:
1.核质分离实验结果显示，AC010789.1在HCT116和SW1116细胞的胞质与胞核中均有表达。
2.通过LncBasePredictedv.2数据库和相关文献共筛选到3个可以与AC010789.1结合的miRNAs(miR-432-3p、miR-7854-3p和miR-4796-3p)。QRT-PCR结果显示，敲减AC010789.1后，miR-432-3p表达量升高最为明显，因此选取miR-432-3p作为候选miRNA。
3.敲减AC010789.1后进行RNAsequencing，以|log2foldchange|＞1且P＜0.05为筛选标准，共获得5735个差异表达的mRNAs，其中2971个mRNAs下调，2764个mRNAs上调。通过GO功能注释分析发现，差异表达mRNAs的功能主要集中在细胞增殖、粘附和迁移等方面。联合RNAsequencing及TargetScan数据库分析，明确ZEB1在AC010789.1敲减组表达下调，且其3UTR含有miR-432-3p的结合位点，因此选取ZEB1作为下游靶基因进行后续研究。
4.QRT-PCR结果表明敲减或者过表达miR-432-3p后AC010789.1表达量明显升高或降低。此外，敲减AC010789.1或过表达miR-432-3p后ZEB1的mRNA和蛋白水平均明显降低。相反，过表达AC010789.1或敲减miR-432-3p后ZEB1的mRNA和蛋白水平均明显升高。Spearman相关分析表明，AC010789.1和miR-432-3p以及miR-432-3p和ZEB1的表达水平在结直肠癌组织中均呈负相关，AC010789.1和ZEB1的表达水平在结直肠癌组织中呈正相关。双荧光素酶报告基因实验显示，AC010789.1和miR-432-3p以及miR-432-3p和ZEB1之间存在结合关系。挽救实验证实ZEB1过表达可部分逆转miR-432-3p过表达对ZEB1表达的抑制作用，抑制miR-432-3p表达后可部分逆转AC010789.1敲减导致的ZEB1mRNA和蛋白水平的降低。
5.通过对RNAsequencing中产生的差异表达的mRNAs进行GO功能注释和KEGG富集分析，发现其主要影响wnt信号通路，其中wnt/β-catenin通路的异常活化与多种肿瘤的发生进展密切相关，因此我们验证了AC010789.1与wnt/β-catenin通路活性的关系。Westernblot结果显示，与对照组相比，AC010789.1稳定敲减组的细胞核β-catenin及总β-catenin蛋白水平均明显降低，而过表达AC010789.1组的细胞核β-catenin及总β-catenin蛋白水平均明显升高。但是，无论敲减还是过表达AC010789.1都不影响细胞质β-catenin蛋白的表达。而且，AC010789.1敲减组中wnt/β-catenin通路下游靶基因cMyc和cyclinD1的蛋白水平明显降低，AC010789.1过表达组中cMyc和cyclinD1的蛋白水平明显升高。此外，敲减miR-432-3p后可部分逆转AC010789.1敲减介导的细胞核β-catenin、cMyc和cyclinD1蛋白的降低。
6.Transwell实验显示，过表达miR-432-3p后结直肠癌细胞迁移和侵袭的能力明显减弱，敲减miR-432-3p后结直肠癌细胞迁移和侵袭的能力明显增强。Westernblot和qRT-PCR实验结果显示，过表达miR-432-3p后E-cadherin的蛋白和mRNA水平均升高，vimentin的蛋白和mRNA水平均降低，敲减miR-432-3p后出现相反的变化趋势。挽救实验证实ZEB1过表达可部分恢复miR-432-3p过表达导致的结直肠癌细胞迁移及侵袭能力的减弱。
7.RTCA实验、平板克隆形成实验、transwell迁移、侵袭实验和免疫荧光实验表明AC010789.1可以通过miR-432-3p促进结直肠癌细胞的增殖、克隆形成、迁移、侵袭和EMT。
结论:
AC010789.1通过miR-432-3p调控ZEB1的表达和wnt/β-catenin通路的活性，进而调控结直肠癌细胞的增殖、迁移、侵袭和EMT。
第四部分血清AC010789.1在结直肠癌中的诊断价值研究
目的:
检测结直肠癌患者和健康对照者血清中AC010789.1的表达水平，分析其对结直肠癌诊断的临床价值。
方法:
1.通过qRT-PCR检测72例结直肠癌患者和72例健康对照者血清中AC010789.1的表达水平，并评估-80℃冰箱保存时间、反复冻融次数以及室温条件放置时间对血清中AC010789.1表达稳定性的影响。
2.采用Mann-WhitneyU检验统计分析血清AC010789.1表达水平与结直肠癌患者临床病理参数之间的关系。
3.利用受试者工作曲线(receiver operating characteristic curve，ROC)下面积(area under curve，AUC)评估血清AC010789.1表达水平对结直肠癌的诊断效能。
结果:
1.QRT-PCR结果显示，与健康对照者相比，结直肠癌患者血清中AC010789.1的表达水平显著升高。血清样本在-80℃冰箱放置1个月、2个月或3个月，反复冻融2次、4次或8次以及室温条件下放置4小时、8小时、12小时或24小时后AC010789.1的表达水平无明显变化。
2.通过Mann-WhitneyU检验分析结直肠癌患者血清中AC010789.1表达水平和临床病理参数的关系，结果显示结直肠癌患者血清中AC010789.1表达水平与肿瘤T分期显著相关，而与年龄、性别及淋巴结转移状态无关。
3.ROC曲线分析发现，AC010789.1对结直肠癌诊断的AUC为0.861(95％CI:0.794-0.913)，诊断敏感性为77.8％，特异性为83.3％。
结论:
血清AC010789.1有望成为结直肠癌新型生物标志物，为结直肠癌的无创性诊断提供了新的途径。