半滑舌鳎是我国重要的海水养殖品种,细菌性疾病的爆发给养殖户带来了严重的经济损失,导致半滑舌鳎养殖问题频发,产量下降。生物技术的发展推动现代种业的发展,也作为良种选育的新手段。溶酶体相关膜蛋白（LAMP）在溶酶体的功能中发挥着重要而多样的作用。LAMP保护细胞质和限制性溶酶体膜本身免受酸性水解酶的作用,并调节溶酶体与其他细胞器（特别是自噬体）的融合、溶酶体蛋白水解活性和吞噬作用。作为自噬激活的关键因子,LAMP2在抗菌免疫机制中还未有报道。除履行结构蛋白的作用外,尚具有多种生物学效应,如自身免疫性疾病发生、自噬体形成、内体融合、胆固醇运输、胸腺发育、肿瘤侵袭和转移等多种生命活动均存在LAMP2的重要调控作用;可直接参与了中性粒细胞的黏附、自噬和抗原递呈。本实验以半滑舌鳎为研究对象,利用分子生物学方法对LAMP2进行分子鉴定,并重点研究其抗病机制。具体研究内容如下:1.半滑舌鳎脑细胞系的建立本研究首先从半滑舌鳎中获得脑组织的细胞系,并对其来源、遗传性别及病毒感染等进行实验,结果显示本研究建立的半滑舌鳎脑细胞系可作为研究细胞与病原体相互作用、基因功能等的体外实验体系。2.半滑舌鳎LAMP2鉴定及亚细胞定位本研究从半滑舌鳎中克隆并鉴定了LAMP2基因,利用分子生物信息学的方法对其进行分析。结果显示,半滑舌鳎LAMP2基因CDS区序列全长1206bp,能够翻译401个氨基酸,前33个氨基酸组成了信号肽,存在跨膜区,具有LAMP结构域,属于疏水性蛋白;目的蛋白与其他LAMP2分子的氨基酸序列相似性较高;系统发育进化树分析,结果显示半滑舌鳎LAMP2与其他硬骨鱼类LAMP2分子亲缘关系最近,位于同一分支,与两栖动物、鸟类及哺乳动物明显分支;为了研究其亚细胞定位,利用真核表达载体构建pEGFP-LAMP2并转染到本研究中建立的半滑舌鳎脑细胞系中,结果显示,LAMP2定位于细胞质中。3.半滑舌鳎抗创伤弧菌相关性分析为了研究半滑舌鳎LAMP2基因调控半滑舌鳎抗创伤弧菌反应中的应用,本实验成功复苏创伤弧菌并注射半滑舌鳎,产生体表溃烂等病变临床症状。采用qRT-PCR方法检测目的基因LAMP2的表达模式。结果显示,在健康半滑舌鳎中LAMP2在脑中表达量最高;注射半滑舌鳎后,在血、头肾、肝脏和脾脏中LAMP2的表达量与对照组相比均存在显著性差异,推测在半滑舌鳎抗创伤弧菌免疫中,LAMP2可能发挥作用。半滑舌鳎LAMP2在先天免疫应答中的功能探究为进一步了解LAMP2在先天免疫应答中的作用及其机制,利用LPS注射活体并刺激细胞,收集样品检测其mRNA的表达量,结果显示,LAMP2在活体水平上呈现表达量上调的趋势,在细胞水平上,呈现表达量下降的趋势;其结果呈现不同的表达模式,推测LAMP2的表达可能受自噬水平的影响,并进一步调控免疫反应。综上所述,本研究建立了半滑舌鳎脑细胞系,克隆并鉴定LAMP2基因,明确了其在半滑舌鳎LAMP2抗菌及先天免疫过程中发挥着重要作用,为进一步研究半滑舌鳎的抗菌先天免疫防御机制提供了理论基础,在养殖业上半滑舌鳎的细菌性疾病的预防和控制提供理论支持。