牙髓根尖周疾病是人类最常见的口腔疾病之一,常规的根管治疗可以保存患牙,但牙齿在丧失了牙髓之后其抗力降低,脆性增加,并丧失感觉功能,尤其是未发育完成的年轻恒牙,更容易发生牙齿的折裂。牙髓再生是患牙获得生物学治疗效果的最佳途径。间充质干细胞（MSCs）被证实可向机体受损部位迁移,在机体器官和组织的再生修复过程中发挥重要的作用,MSCs的迁移与多种趋化因子密切相关,基质细胞衍生因子-1（SDF-1）是其中最重要的一员。由于牙髓具有独特的组织学结构和环境,牙髓组织的再生修复面临更大的挑战。本研究以促进内源性干细胞归巢参与牙髓再生为目的,评价SDF-1/CXCR4生物轴趋化体内干细胞归巢,以及在内源性牙髓再生过程中所发挥的生物学作用,为牙髓根尖周病的生物学治疗提供新思路。研究主要分为以下4个部分:第一章SDF-1对大鼠BMSCs的体外趋化作用目的:分离、培养、鉴定大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）,检测BMSCs的CXCR4表达,体外评价SDF-1对BMSCs的趋化作用,为下一步研究奠定基础。方法:通过骨髓贴壁法体外分离、培养大鼠BMSCs,通过形态学观察、流式细胞仪检测细胞表面标记物、多向分化潜能鉴定,免疫组化检测BMSCs CXCR4的表达情况。Transwell小室体外评价SDF-1趋化BMSCs迁移的作用。结果:细胞形态呈梭形,形态均一,呈放射状排列,分裂增殖速度较快,倍增时间为3d,可连续稳定传代至10代。生长曲线显示生长活跃。流式细胞仪检测第3代细胞CD29,CD44呈阳性表达,CD34,CD45呈阴性表达。多向分化潜能诱导显示具有成脂、成骨能力,免疫组织化学染色显示BMSCs表达CXCR4。SDF-1趋化BMSCs迁移的体外结果显示:SDF-1明显促进BMSCs的迁移,迁移作用的强度与SDF-1的浓度有关,以50 ng/ml条件下细胞的迁移数最多,CXCR4受体阻断剂AMD3100明显抑制SDF-1的趋化作用,但不能完全阻断。小结:本研究所采用的分离培养方法可以获得具有干细胞特性标志和多向分化潜能的BMSCs,BMSCs表达CXCR4阳性。体外验证SDF-1对BMSCs的迁移有明显促进作用,趋化作用的强度与SDF-1的浓度有关,以50 ng/ml条件下作用最强,CXCR4的阻断剂AMD3100可以明显抑制BMSCs的迁移,但不能完全阻断细胞的迁移。第二章根尖周损伤对骨髓细胞表达CXCR4的影响目的:通过评价根尖周损伤刺激出血所触发的骨髓中细胞表达CXCR4的变化,探讨局部损伤与全身系统动员干细胞反应之间的关系。方法:72只大鼠随机分为实验组（n=56）、模型组（n=8）和对照组（n=8）。模型组去除牙髓,根管封药一周后处死动物。实验组去除牙髓,根管内封药一周后进行根尖周损伤诱导出血,在根尖损伤后12h、1d、2d、4d、7d、14d及21d全麻下处死动物,采集股骨,免疫组化检测骨髓中CXCR4的表达,以阳性细胞表达面积的百分比计量。结果:股骨中CXCR4阳性表达的细胞主要分布在股骨近端的红髓内,所有的组别及时间点在骨髓中均有CXCR4阳性表达的细胞,它们主要分布在血管中。与空白对照组相比,模型组和实验组在7个不同的时间里骨髓中的血管均有不同程度的扩张,而在扩张的血管中聚集了大量的CXCR4阳性表达的细胞。以CXCR4阳性表达的细胞在视野中所占面积的百分比计,与正常组和模型组比较,实验组在12h、1d、4d、7d、14d及21d表达均有明显增强,2d时的表达虽然有所增强,但与空白对照组和模型组相比无明显差异。实验组内7个时间点相比较,4d及21d时CXCR4阳性表达明显高于2d。空白组和模型组两组之间的表达差异无统计学意义。小结:CXCR4阳性表达的细胞主要分布在股骨的红髓中,并主要位于血管内。根尖周损伤后骨髓中的血管扩张,血管中CXCR4阳性表达的细胞明显增多。结果提示根尖周组织的损伤,可以触发骨髓发生一系列的变化,为内源性干细胞的储备和释放,参与组织的再生和修复提供基础。第三章CXCR4^+/-表达骨髓间充质干细胞的示踪与归巢目的:采用基因技术对BMSCs CXCR4的表达水平进行干预和示踪。通过根尖局部组织损伤与根管内植入SDF-1两种不同的处理方法,体内评价SDF-1/CXCR4生物轴对外周血中CXCR4沉默或过表达BMSCs趋化归巢的生物学效应及影响因素。方法:1、对BMSCs CXCR4表达水平的干预和示踪大鼠CXCR4基因过表达的慢病毒载体及CXCR4基因沉默shCXCR4慢病毒载体分别用GFP绿色荧光和Mcherry红色荧光进行标记,转染第3代雄性BMSCs,倒置显微镜观察细胞荧光表达情况,分别采用qPCR和免疫组化检测BMSCs转染后CXCR4 mRNA和CXCR4蛋白的表达水平。2、BMSCs的归巢及影响因素1)自身左右对照:4只雌性大鼠左右侧下颌第一磨牙均纳入研究。左侧根管内植入SDF-1凝胶,右侧根尖周刺激出血后,将大鼠分为两组,每组2只,过表达CXCR4-BMSCs组（CXCR4-BMSCs）通过尾静脉注射CXCR4-BMSCs悬液,CXCR4基因沉默BMSCs组（shCXCR4-BMSCs）注射shCXCR4-BMSCs悬液,24h后处死大鼠,收集下颌骨,心,肺,肝,脾,肾。样本处理后进行原位杂交检测雄性SRY染色体,观察在同一个体内不同的处理方法对CXCR4-BMSCs和shCXCR4-BMSCs在体内迁移的影响。2)异体对照:10只雌性大鼠仅右下颌第一磨牙纳入研究。（1）CXCR4-BMSCs的归巢:6只大鼠分为根管内植入SDF-1组和牙髓血运重建组,每组3只大鼠,根管及根尖周处理后通过尾静脉注射CXCR4-BMSCs。（2）正常表达CXCR4的BMSCs归巢:4只大鼠分为两组,每组2只大鼠,分别进行根管内植入SDF-1和牙髓血运重建行根尖周损伤刺激出血,处理后通过尾静脉注射BMSCs。24h后处死大鼠收集下颌骨。样本处理后进行原位杂交检测SRY染色体,并且对所有大鼠下颌骨样本进行HE染色观察组织学改变。结果:1、对BMSCs CXCR4表达水平的干预和示踪重组GFP-NC、GFP-shCXCR4、Mcherry-NC和Mcherry-CXCR4慢病毒分别转染BMSCs,四天后在荧光显微镜下均可见有荧光,说明带有荧光蛋白（Mcherry或GFP）及CXCR4基因的慢病毒转染细胞后可成功表达荧光蛋白（Mcherry或GFP）,即病毒成功转染入BMSCs中。qPCR与免疫组化结果显示:与阴性对照和正常组相比较,过表达CXCR4组的CXCR4-mRNA表达水平明显上调（P<0.01）,沉默组下调（P<0.05）,单独携带荧光蛋白的阴性对照组与正常组比较无明显改变（P>0.05）。同样的,过表达组CXCR4蛋白表达水平明显上调（P≤0.01）,沉默组CXCR4表达下调明显（P<0.01）,两个阴性对照组与正常组无明显改变（P>0.05）。2、BMSCs的归巢及影响因素2.1自身左右对照2.1.1 HE染色组织学表现:根尖周损伤组在根尖周组织损伤24h后,根管及根尖周组织有大量炎症细胞浸润,SDF-1组在根管内植入SDF-1水凝胶胶原支架24h后,根尖周组织末见炎症细胞浸润,根管内见少数炎症细胞附着于凝胶支架上。2.1.2原位杂交检测雄性SRY染色体尾静脉注射CXCR4-BMSCs后,无论是根尖周局部损伤还是根管内植入SDF-1,在根尖周和根管内均可见携带SRY基因的CXCR4-BMSCs的存在,但根尖周损伤侧CXCR4-BMSCs的细胞数明显多于对侧根管内植入SDF-1的细胞数。尾静脉注射shCXCR4-BMSCs大鼠的根尖周和根管内均没有见到携带SRY基因的BMSCs。2.2异体对照通过原位杂交检测雄性SRY染色体追踪CXCR4-BMSCs和BMSCs在根尖周和根管内的分布,结果显示:不同个体的右下颌第一磨牙,无论是进行根尖损伤还是根管内植入SDF-1处理,两组在根管内和根尖周组织内均可见大量呈棕褐色的CXCR4-BMSCs,根尖周组织归巢的细胞多于根管内。而正常表达CXCR4的BMSCs在根尖周和根管内的数量明显较注射CXCR4-BMSCs少。3、CXCR4-BMSCs和shCXCR4-BMSCs在全身器官中的分布通过尾静脉注射CXCR4-BMSCs,肺、肾脏中有较多表达SRY基因的CXCR4-BMSCs聚集,而在心脏、肝脏和脾脏组织中仅见少量SRY基因阳性的CXCR4-BMSCs。通过尾静脉注射shCXCR4-BMSCs,可见表达SRY基因的shCXCR4-BMSCs主要存在于脾脏,其次是肾脏和肺,而心脏和肝脏组织中末见有SRY基因阳性的shCXCR4-BMSCs。小结:1、本研究成功构建慢病毒载体CXCR4基因过表达雄性BMSCs及CXCR4基因沉默雄性BMSCs,并成功使用荧光蛋白进行标记,采用原位杂交技术检测雄性SRY染色体对细胞的迁移进行追踪。2、无论是根尖周损伤还是人为的在根管内植入SDF-1均可促使外周血中的CXCR4表达阳性的细胞归巢至根管内和根尖周组织。3、同一个体内如果存在多种原因导致的多处局部SDF-1浓度的升高,则相互之间可能存在干扰,以SDF-1局部浓度最高处的趋化作用最强。4、炎症反应有可能增强CXCR4阳性表达的细胞对SDF-1的敏感性,使趋化作用增强。5、SDF-1的趋化作用受趋化细胞CXCR4表达水平的影响,表达水平越高,归巢能力越高,SDF-1对不表达CXCR4的细胞不具有趋化归巢的作用。6、CXCR4-BMSCs和shCXCR4-BMSCs在全身器官中的分布不同,CXCR4-BMSCs以肺、肾脏为主,shCXCR4-BMSCs以肺、脾脏为主。第四章组织学评价SDF-1在牙髓再生中的作用目的:比较根尖周刺激出血和根管内植入SDF-1两种方法诱导无髓根管内新生组织的组织学表现,探讨SDF-1在牙髓再生过程中所发挥的作用和机制。方法:48只8周龄雌性大鼠随机分4组,双侧下颌第一磨牙去髓封药一周后,左侧植入SDF-1凝胶,右侧根尖周刺激出血后进行随机分组（每组12只大鼠）,BMSCs组经大鼠尾静脉注射BMSCs单细胞悬液1mL,AMD3100组注射经CXCR4阻断剂AMD3100预处理的BMSCs单细胞悬液1mL,F12组单独注射DMEM-F12培养液1mL,第4组为空白对照,不注射。各组分别在15天（n=6）和30天（n=6）处死大鼠,收集下颌骨。HE染色观察根管内新生组织的组织学特征,SRYmRNA原位杂交检测经尾静脉注入的细胞在组织中的分布。结果:HE染色右侧根尖周刺激出血后15天,除空白对照组外,其余三组根尖周组织均可见程度不一的炎症细胞浸润,BMSCs组、F12组和空白组的根管内可见骨样细胞,AMD3100组根管内可见牙本质/骨样组织的蓝染色基质。左侧根管内植入SDF-1凝胶后15天,BMSCs组、AMD3100组和空白组的根尖周可见炎症细胞浸润,BMSCs组和AMD3100组的根管内见含有血管样的新生组织,空白组的根管内见有血管样的网状样的结构。根尖周刺激出血后30天,右侧根尖周组织均可见有不同程度的炎症细胞浸润。BMSCs组的根管内可见含有血管的结缔组织样结构。AMD3100组的根管内可见骨组织以及牙本质组织样结构。F12组根管内见似骨组织的蓝色基质。空白组的根管内可见牙本质样组织结构。左侧植入SDF-1凝胶后30天,BMSCs组的根管内可见含有血管样的疏松结缔组织样结构。AMD3100组的根管内可见含有骨样组织结构。F12组根管充满疏松基质结构。空白组的根管内可见含有血管样的疏松基质结构。原位杂交从尾静脉注射CXCR4⁺表达的BMSCs后15天,损伤侧和根管内植入SDF-1侧下颌磨牙均可见携带SRY染色体的雄性BMSCs迁移至根管和根尖周组织,其它组在根管和根尖周组织内末见有携带SRY染色体的细胞。尾静脉注射CXCR4⁺表达的BMSCs后30天,双侧下颌第一磨牙均可见携带SRY染色体的BMSCs细胞归巢至根尖周损伤区以及根管内。右侧损伤侧牙周组织和根管内可见数量较多的携带雄性大鼠特征基因的BMSCs,植入SDF-1侧下颌第一磨牙的根管内雄性大鼠BMSCs的数量相对较少。其它组根管内以及根尖周末见携带SRY染色体的细胞。小结:1、SDF-1/CXCR4生物轴可以趋化体内远位的干细胞归巢到根管内并参与组织再生修复。2、SDF-1/CXCR4生物轴可能更有利于在根管内形成血管化的结缔组织。全文结论:1、骨髓间充质干细胞表达CXCR4,SDF-1对表达CXCR4⁺的骨髓间充质干细胞具有趋化作用,趋化作用的强度与SDF-1的浓度有关。2、根尖周局部刺激损伤可以使股骨红髓中血管扩张,血管中表达CXCR4的细胞数量增加。3、利用慢病毒转染可以成功构建CXCR4过表达和表达沉默的BMSCs,并成功示踪其归巢到根尖周和根管内。4、无论是通过根尖周刺激出血或根管内植入SDF-1,外周血中CXCR4+表达的骨髓间充质干细胞均可以归巢到根管内参与牙髓再生,但根管内植入SDF-1更利于血管化的新生组织再生。5、SDF-1的趋化作用受多种因素的影响:（1）细胞CXCR4的表达水平;（2）炎症反应;（3）是否存在多处损伤或炎症情况。6、CXCR4-BMSCs和shCXCR4-BMSCs在全身器官中的分布不同,CXCR4-BMSCs以肺、肾脏为主,shCXCR4-BMSCs以肺、脾脏为主。7、SDF-1/CXCR4生物轴在牙髓再生过程中可发挥趋化体内干细胞归巢到根管内的作用,但归巢干细胞的增殖和分化方面的作用机制尚待进一步的深入研究。