论文部分内容阅读
近年来,我国沿海有害藻类水华频发,给海洋生态环境、人类健康和公众财产造成了重大威胁,及时预警和监测有害藻类水华的发生迫在眉睫。然而,赤潮微藻的体型较小、分类学复杂,不容易进行区分。传统的显微镜检测方法费时费力且准确度不高,且海洋自然环境中的有害藻种多种多样,有必要开发一种可并行检测多种有害微藻的方法。因此,本研究建立了一种能同时检测六种微藻的检测方法——多重PCR（mutiplex PCR,m PCR）检测技术。本研究以中国沿海常见藻华形成种,包括东海原甲藻（Prorocentrum donghaiense,Pd）、骨条藻（Skeletonema spp.,Ss）、米氏凯伦藻（Karenia mikimotoi,Km）、锥状斯氏藻（Scrippsiella trochoidea,St）、海洋卡盾藻（Chattonella marina,Cm）和剧毒卡尔藻（Karlodinium veneficum,Kv）为目标,建立了一种能同时识别这些藻种的的多重PCR检测技术。首先通过克隆测序对6个目标藻种进行分子鉴定。提取目标藻种基因组DNA,对其转录内间隔区（internal transcribed spacers,ITS）或者核糖体大亚基（large subunit,LSU）D1-D2区进行PCR扩增。扩增产物进行切胶回收,经转化与载体连接,导入感受态细胞中进行克隆,筛选阳性克隆菌株送去测序公司测序。将所得结果在NCBI上进行比对分析,确定其为目标藻种。根据比对结果,从Genebank中下载亲缘关系较近的同属藻种或者相似度较高的藻种序列。在Bioedit上将下载的序列与目标藻种的序列进行比对分析,目测找到种或者属特异性区域,用Primer Premier 5.0软件设计符合要求的特异性引物。设计的各目标藻的特异性引物通过与25种我国沿海常见的微藻进行交叉扩增测试,结果证明各引物特异性良好。m PCR的特异性引物分别靶向目标藻种的ITS rDNA或LSU rDNA基因序列设计,扩增目的片段大小分别为437 bp、343 bp、254 bp、198 bp、137 bp和83 bp。初步建立m PCR体系,对反应条件进行了优化,确定最佳参数如下:Kv、Cm、Ss、St、Km和Pd的引物浓度分别为0.10μM、0.15μM、0.10μM、0.15μM、0.20μM和0.20μM;Mg2+浓度,3.5 m M;d NTP浓度,0.6 m M;Taq聚合酶浓度,0.10 UμL-1;退火温度,52°C。后续实验均由优化后的m PCR体系进行。通过在m PCR扩增体系中加入不同目标藻种的DNA模板的组合,进一步证实m PCR体系具有特异性。干扰扩增测试表明,m PCR扩增体系不受背景DNA浓度的影响。灵敏度测试表明,m PCR对Kv、Cm、Km和Pd的最低检测极限为0.6 ngμL-1,对Ss和St的最低检测极限为0.06 ngμL-1。模拟自然水样测试表明,Km、Pd和Kv的最低检测极限为60 cells m L-1,Cm、Ss和St的最低检测极限为6cells·m L-1。通过对从东海采集的野外样品进行的自然水样检测,进一步证实了m PCR体系的准确性和实用性。本研究建立的m PCR具有多重分析的特点,特异性强,检测体系稳定,可作为这些藻种的形态鉴定法的重要补充。