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研究目的:本课题研究TCP1在胰腺癌增殖、周期和转移中的作用及其机制,以高表达TCP1的胰腺癌细胞作为研究对象,通过Tet-on系统介导的基因沉默技术,在胰腺癌细胞中敲减TCP1,观察细胞增殖、周期和转移的变化,并探究其中的机制;运用免疫缺陷鼠皮下植瘤实验进一步验证沉默TCP1抑制胰腺癌细胞成瘤能力。通过免疫组化技术明确TCP1在胰腺癌癌旁组织和癌组织患者样本中的表达情况,分析其表达量与病理分化的关系,探究TCP1作为临床诊断指标的可能性。研究方法:1、应用Western blot检测三种胰腺癌细胞系PANC-1、Bx PC-3、c FPAC-1的TCP1表达水平,明确TCP1在胰腺癌细胞中的表达量,筛选TCP1高表达的细胞株作为研究对象。2、构建Tet-on sh TCP1慢病毒载体质粒,制备sh TCP1慢病毒,感染高表达TCP1的胰腺癌细胞,应用Western blot检测沉默TCP1的效率。3、MTT法和细胞计数法绘制细胞生长曲线、克隆形成实验检验敲减TCP1抑制胰腺癌细胞增殖能力;进行Transwell实验来检测敲减TCP1抑制胰腺癌细胞迁移和侵袭;为探明TCP1对细胞周期的影响,运用流式细胞术检测胰腺癌细胞敲减TCP1后周期的变化。4、提取敲减TCP1的胰腺癌细胞总蛋白,用Western blot检测增殖、周期和EMT相关蛋白,探究TCP1影响胰腺癌发生发展的机制。5、通过免疫缺陷小鼠皮下植瘤模型检测敲减TCP1的胰腺癌细胞成瘤能力变化,分别记录瘤块生长曲线、瘤重等数据。6、免疫组化检测197例胰腺癌患者及193例癌旁样本中TCP1表达情况,统计分析TCP1在不同分化程度的胰腺癌和正常胰腺导管组织表达差异。研究结果:1、在PANC-1、Bx PC-3、c FPAC-1三株胰腺癌细胞中,PANC-1细胞TCP1表达量最高,Bx PC-3次之,c FPAC-1最低。因此选择PANC-1和Bx PC-3进行细胞功能学实验。2、成功构建Tet-on系统敲减TCP1慢病毒载体,包装Tet-on sh TCP1慢病毒并感染PANC-1细胞,Western blot检测TCP1蛋白相较于对照组明显下调,建立稳定可诱导敲减TCP1的PANC-1细胞。3、将敲减TCP1的PANC-1细胞进行MTT生长曲线实验,发现细胞增殖受到抑制,抑制率为55.8%;进一步以计数法验证,抑制率为55.6%。通过克隆形成实验检测敲减TCP1抑制PANC-1细胞克隆形成能力,抑制率达67%。流式细胞术检测细胞周期发现敲减TCP1后G0/G1期细胞增多,说明细胞周期阻滞在G0/G1期。Transwell实验结果表明敲减TCP1抑制PANC-1细胞转移,实验为迁移和侵袭两部分,我们观察到敲减TCP1后穿膜细胞明显减少,抑制率分别为83.6%和83.1%。4、在Bx PC-3细胞系验证上述实验结果,MTT法检测敲减TCP1后抑制细胞增殖达62.6%,克隆形成数量减少了84.6%,Transwell实验中细胞迁移减少了94.3%。5、Wester blot检测敲减TCP1后PANC-1细胞蛋白的变化,我们发现增殖相关蛋白p Akt-308、p Akt-473、m TOR、NF-κB、Raf-1、c-Myc;周期相关蛋白CDK2、CDK6和间质标记蛋白Vimentin、ZEB1蛋白表达水平明显下调,上皮标记蛋白E-cadherin的表达水平上调。6、通过免疫缺陷小鼠皮下植瘤实验验证细胞模型结果,发现敲减TCP1的PANC-1所形成的瘤块显著小于对照组,抑瘤率为78.7%,敲减组瘤重较对照组减少了76.8%,说明敲减TCP1抑制了PANC-1细胞的成瘤能力。7、免疫组化实验结果说明TCP1在癌旁导管上皮组织中有低表达,而在癌组织表达量较高,TCP1表达水平随胰腺癌组织分化水平降低而增高。研究结论:1、敲减TCP1在体外抑制PANC-1细胞增殖、延缓细胞周期进程和抑制细胞侵袭能力。2、敲减TCP1影响多种蛋白表达,推测TCP1可能通过p Akt-308、p Akt-473、m TOR、NF-κB、Raf-1、c-Myc、CDK2、CDK6、Vimentin、ZEB1和E-cadherin调控PANC-1细胞增殖、转移的多项行为。3、在体内验证敲减TCP1可抑制PANC-1细胞瘤块生长,为胰腺癌治疗提供了新的靶标。4、TCP1随胰腺癌组织分化程度较低而增高,具有成为临床诊断标记物的潜能。