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【研究背景】 癫痫是神经内科的常见疾病,患病率为0.5~1％。遗传因素在癫痫的发病中起着重要作用。编码Ⅰ型电压门控钠离子通道的SCN1A基因被认为是癫痫的主要致病基因。SCN1A基因不同类型的突变可引发不同的癫痫综合征。最常见的是全面性癫痫伴热性惊厥附加症(GEFS+)和婴儿重症肌阵挛癫痫(SMEI)。在绝大多数报道中,SCN1A基因截短突变引发临床症状较重的SMEI。本课题组前期工作发现SCN1A基因截短突变c.433_434delAT可导致临床症状较轻的部分性发作癫痫。所以本研究选取临床症状轻重不同的癫痫患者所携带的SCN1A基因截短突变c.433_434delAT和c.840G>A,探讨携带这两个SCN1A基因截短突变患者的临床表型有何不同,并对其截短蛋白的亚细胞定位进行研究。 【研究目的】 本研究对携带SCN1A基因截短突变c.433_434delAT和c.840G>A患者的临床表型进行分析比较,观察其截短蛋白的亚细胞定位情况,以探讨SCN1A基因截短突变导致不同临床表型的原因。 【研究方法】 通过详细收集携带这两个突变患者的临床资料,根据国际抗癫痫联盟(ILAE)制定的诊断标准,对其进行诊断,并对其临床症状进行分析比较。采用基因克隆技术,构建出表达SCN1A基因截短突变的质粒(pYFP-MuSCN1A),在NaV1.1蛋白的N端的第4和第5个氨基酸之间插入黄色荧光蛋白编码序列(YFP)。通过脂质体法转染技术,将截短突变质粒与野生型质粒分别单独转染入人胚肾细胞(HEK293)和人类神经母细胞瘤株细胞(SH-SY5Y),通过激光扫描共聚焦显微镜观察他们编码的截短蛋白的亚细胞定位情况。并将突变质粒与荧光真核表达定位载体pECFP-ER共转染入HEK293细胞和SH-SY5Y细胞,通过与内质网和膜标记物的对比,进一步观察比较这两个截短蛋白的亚细胞定位情况。 【结果】 1.携带SCN1A基因截短突变c.433_434delAT的患者临床表型为PEFS+,携带SCN1A基因截短突变c.840G>A的患者临床表型为SMEI。 2.成功构建携带黄色荧光蛋白的SCN1A基因截短突变表达质粒 通过双酶切鉴定表达SCN1A基因截短突变c.433_434delAT和c.840G>A的质粒,得到与预计相符的目的条带。将鉴定正确的截短突变质粒送测序,测序结果与Genebank中提交的SCN1A基因序列进行比对,除突变位点外其余序列完全一致。 3.SCN1A基因截短突变c.433_434delAT和c.840G>A编码的截短蛋白在HEK293细胞和SH-SY5Y细胞中的亚细胞定位情况 通过激光扫描共聚焦显微镜观察,SCN1A基因截短突变c.433_434delAT和c.840G>A编码的截短蛋白在HEK293细胞和SH-SY5Y细胞的胞浆中表达,而正常NaV1.1蛋白在细胞膜上表达。这两个突变所编码的截短蛋白在HEK293细胞和SH-SY5Y细胞中的亚细胞定位情况未见明显差异。 【结论】 (1)SCN1A基因截短突变可以导致临床症状轻重不同的癫痫。 (2)SCN1A基因截短突变c.433_434delAT和c.840G>A编码的截短蛋白在HEK293细胞和SH-SY5Y细胞的胞浆中表达,未能在细胞膜上表达,这可能是它们引发癫痫的原因。 (3)SCN1A基因截短突变导致临床症状轻重不同癫痫的机制还不明确,有待进一步研究。